Aβ多肽的T細(xì)胞免疫刺激抑制研究及人源抗體基因真核表達(dá)體系的構(gòu)建.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年人中常見(jiàn)的一種癡呆癥。主要的病理學(xué)特征包括腦內(nèi)的細(xì)胞外β—淀粉樣多肽(β—amyloidpeptide，Aβ)的沉積導(dǎo)致的老年斑、細(xì)胞內(nèi)過(guò)度磷酸化tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元細(xì)胞的缺失營(yíng)養(yǎng)壞死。 近年來(lái)的研究充分表明，無(wú)論是采用Aβ作為抗原的主動(dòng)免疫刺激或者直接注射抗Aβ抗體，都不但可以減少和阻抑AD

2、轉(zhuǎn)基因鼠中Aβ的沉積，還可以明顯改善實(shí)驗(yàn)鼠的行為及認(rèn)知障礙。目前免疫治療已經(jīng)成為治療AD的重要途徑，并取得了很大進(jìn)展。 AD主動(dòng)免疫治療臨床Ⅱ期研究中發(fā)現(xiàn)Aβ免疫后6％的患者大腦出現(xiàn)腦炎反應(yīng)的毒副作用。目前導(dǎo)致腦膜腦炎的具體原因尚不清楚，但相關(guān)研究提示腦炎的發(fā)生可能是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的結(jié)果，與免疫引起的T淋巴細(xì)胞亞型(Thelpercell1/Thelpercell2，Th1/Th2)的平衡有關(guān)，如能降低或抑制Th1

3、反應(yīng)、增強(qiáng)Th2的反應(yīng)，將增加AD免疫治療的安全性。 目前被動(dòng)免疫研究結(jié)果大都是用單克隆抗體在動(dòng)物試驗(yàn)中得到的，雜交瘤技術(shù)制備的單抗多為鼠源性，對(duì)于人體來(lái)說(shuō)屬于異種蛋白，且其不能有效地活化補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步的研究需要將鼠源抗體轉(zhuǎn)換成人源化的抗體才能應(yīng)用于人體，但這種方法技術(shù)復(fù)雜難度高，即使改造后也難以得到百分之百的人源化，且有可能在改造過(guò)程中使原來(lái)抗體的親和力和特異性降低。 針對(duì)AD免疫學(xué)治療中存在的問(wèn)

4、題，本課題在上述兩個(gè)方面進(jìn)行了初步探討。 本課題第一部分利用不同的Aβ多肽序列與佐劑的組合，觀察體液免疫和細(xì)胞免疫的水平高低，通過(guò)細(xì)胞因子的測(cè)定分析佐劑、抗原的序列長(zhǎng)短及T細(xì)胞刺激表位這三種因素引起的T淋巴細(xì)胞亞型的不同刺激和影響，探討導(dǎo)致免疫毒性反應(yīng)的具體因素和抑制途徑。將BALB/c小鼠隨機(jī)分組：鋁(Al)佐劑對(duì)照組、Aβ42+福氏佐劑(CFA)組、Aβ42+Al組、Aβ40+Al組、Aβ40(E22A)+Al組，每組8只。

5、經(jīng)初次免疫和3次加強(qiáng)免疫后，檢測(cè)抗體效價(jià)，培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞，分別用各自抗原刺激，48h后用雙抗夾心ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中IFN—γ、IL—2、TNF-α和IL—4的含量。72h后用CCK—8法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)Aβ免疫的4個(gè)試驗(yàn)組血清中均有特異性抗Aβ的抗體產(chǎn)生。脾淋巴細(xì)胞經(jīng)各自抗原刺激后，均出現(xiàn)脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，Aβ42+CFA組分泌的代表Th1型的細(xì)胞因子含量最

6、高，Ap40(E22A)+Al組則有顯著降低(P<0.01)。其中Aβ40及突變型+Al組與Aβ42+Al組相比，分泌的Th1型細(xì)胞因子也有明顯降低(P<0.05)。因此Aβ40(E22A)+Al組對(duì)T細(xì)胞的毒性作用最低，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中可能具有更好的安全性。 本課題第二部分研究?jī)?nèi)容為抗Aβ人源抗體基因真核表達(dá)體系的構(gòu)建。本室利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到了抗Aβ的抗體，通過(guò)篩選直接得到人源抗體，避免了對(duì)通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體的

7、人源化改造過(guò)程。首先將scFv抗體基因與合適的信號(hào)肽基因及人IgG抗體恒定區(qū)基因重組，構(gòu)建成全抗體基因表達(dá)體系，以增加抗體穩(wěn)定性、延長(zhǎng)半衰期、提高抗體性能。為了提高抗體的安全性，還將抗體基因的Fc段的3個(gè)重要位點(diǎn)進(jìn)行突變，以期減少T細(xì)胞反應(yīng)和少腦部的微血管出血反應(yīng)。最后選用真核表達(dá)載體pcDNA3.1，將目的基因連入真核表達(dá)載體中，輕重鏈做共轉(zhuǎn)染COS—7、CHO真核細(xì)胞表達(dá)，但是目前沒(méi)有檢測(cè)到抗體基因在COS—7及CHO中的表達(dá)，沒(méi)有

8、表達(dá)的原因可能與抗體基因的可變區(qū)序列及親和力有關(guān)。 Ap疫苗及抗體的安全性問(wèn)題是當(dāng)今AD免疫治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一。本課題一方面從探討降低免疫反應(yīng)的T細(xì)胞毒性作用的途徑和增加抗原抗體反應(yīng)的人體安全性適應(yīng)性入手，另一方面構(gòu)建了抗Aβ人源抗體基因的真核表達(dá)體系，在AD的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫兩方面做了探索研究。今后，如果能篩選出適宜的抗原及佐劑的組合，使Th細(xì)胞發(fā)生向Th2的極化，那么極有可能避免臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的腦膜腦炎不良反應(yīng)的問(wèn)題，為A