抑癌基因Numb在惡性胸膜間皮瘤中表達(dá)的臨床意義及其功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 惡性胸膜間皮瘤(malignantpleuralmesothelioma，MPM)是一種少見的胸膜部侵襲性腫瘤，預(yù)后極差。它的發(fā)病通常與接觸石棉有關(guān)，盡管自19世紀(jì)70年代以來石棉的使用廣受限制，但接觸后的長期潛伏期使間皮瘤的發(fā)病率正持續(xù)上升。預(yù)計(jì)在2010-2020年間，工業(yè)發(fā)達(dá)國家惡性間皮瘤的死亡率將達(dá)到高峰。根據(jù)組織形態(tài)學(xué)分類，MPM可分為上皮型、肉瘤樣型（纖維型）和混合型三種類型，以上皮型多見。本

2、病傳統(tǒng)治療效果差，確診后中位生存期約為10-12個月。因此，對MPM有效的診療措施亟待研究。近些年來，基因靶向治療在腫瘤領(lǐng)域的成功應(yīng)用為MPM尋求有效的治療方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 Numb是生物體內(nèi)最重要的細(xì)胞命運(yùn)決定因子之一，被認(rèn)為參與多種惡性腫瘤的形成，被認(rèn)為是頗具希望的抑癌基因。Numb是一種膜相關(guān)蛋白，其結(jié)構(gòu)包含一個磷酸酪氨酸結(jié)合域(phosphotyrosinebinding，PTB)和一個富脯氨酸域(proliner

3、ichregion，PRR);靠近氨基端的PTB域是Numb作用的關(guān)鍵部位，可與E3泛素連接酶Mdm2，Lnx，Siah1，Itch相互作用（能夠?qū)⒛康牡鞍踪|(zhì)多聚泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解）。在Numb與腫瘤形成的研究中發(fā)現(xiàn)，Numb通過參與維持細(xì)胞極性和不對稱分裂，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)泛素化降解，抑制Notch，Hedgehog-Gli(簡稱Hh-Gli或Hh)信號傳導(dǎo)通路，上調(diào)P53活性而廣泛參與細(xì)胞增殖與分化、凋亡與再生等腫瘤發(fā)生

4、的眾多重要的病理生理過程，發(fā)揮其抑制腫瘤形成的作用。最近的研究表明，Numb在乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，唾液腺癌，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等某些人類腫瘤中都有不同程度的表達(dá)缺失;在對人小腦髓母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)Numb能夠通過介導(dǎo)Itch依賴的泛素化降解Gli1，從而抑制Hh-Gli通路。然而，Numb在MPM中的表達(dá)、對Gli1的調(diào)控作用以及Numb與腫瘤形成的關(guān)系尚未見報(bào)道。
　　 為了探討Numb在MPM發(fā)生、發(fā)展中的作用，進(jìn)一步以Nu

5、mb為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療提供理論依據(jù)，本論文從以下三個方面進(jìn)行了研究:
　　 一.Numb、Gli1在MPM組織中的表達(dá)及其臨床意義;
　　 二.Numb在MPM細(xì)胞株NCI-H2452中的表達(dá)及對Gli1的調(diào)控作用;
　　 三.過表達(dá)Numb對NCI-H2452細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一.探討Numb、Gli1在MPM組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　 免疫

6、組織化學(xué)法檢測Numb、Gli1在61例MPM組織及22例正常胸膜組織中的表達(dá)，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;Kruskal-Wallis或Mann-Whitney法檢測Numb、Gli1在MPM中表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;Spearman等級相關(guān)分析檢驗(yàn)Numb與Gli1的相互關(guān)系;Kaplan-Meier法log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，Cox回歸進(jìn)行多因素生存分析，檢測Numb、Gli1及各項(xiàng)臨床病理參數(shù)對預(yù)后的影響。

7、　　 二.研究Numb在MPM細(xì)胞株NCI-H2452中的表達(dá)及對Gli1的調(diào)控作用
　　 1.首先用qRT-PCR及Westernblot方法檢測了Numb在NCI-H2452細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)我們將已被證明表達(dá)Numb的人胚腎細(xì)胞293T作為對照;Westernblot方法檢測蛋白酶體抑制劑MG132作用于NCI-H2452細(xì)胞后對Numb蛋白表達(dá)的影響。
　　 2.Numb表達(dá)載體體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NCI-H2452細(xì)

8、胞，Westernblot方法檢測Numb、Gli1表達(dá);蛋白酶體抑制劑MG132作用于Numb轉(zhuǎn)染組，Westernblot方法檢測對Gli1表達(dá)的影響。
　　 三.檢測過表達(dá)Numb對MPM細(xì)胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化療敏感性的影響
　　 1.為檢測過表達(dá)Numb對NCI-H2452細(xì)胞增殖能力的影響，分別于轉(zhuǎn)染后48、72h采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。
　　 2.為檢測過表達(dá)Numb對NCI-H2

9、452細(xì)胞凋亡的影響，轉(zhuǎn)染后72h采用Hoechst染色和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化和凋亡率。
　　 3.為研究Numb促進(jìn)NCI-H2452細(xì)胞凋亡的機(jī)制，采用Westernblot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase3，9以及細(xì)胞色素C、XIAP、survivin的變化。
　　 4.為了進(jìn)一步確定Numb對MPM化療敏感性的影響，過表達(dá)Numb后分別加入3種不同的化療藥物順

10、鉑、培美曲塞、卡鉑作用24h，采用MTT方法檢測細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)果：
　　 一.Numb、Gli1在MPM組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　 Numb陽性表達(dá)率在MPM組明顯低于正常對照組(P＜0.05);MPM組織中Numb表達(dá)與Ki-67標(biāo)記指數(shù)密切相關(guān)，Ki-67≤25％的患者中Numb表達(dá)強(qiáng)，Ki-67＞25％的患者中Numb表達(dá)弱(P＜0.05)。Gli1陽性表達(dá)率在MPM組明顯高于正常對照組(P＜0

11、.05);Gli1胞核表達(dá)與IMIG分期密切相關(guān)，IMIG分期為初期的患者Gli1表達(dá)弱，進(jìn)展期的患者Gli1表達(dá)強(qiáng)(P＜0.05)。在MPM組織中，Numb表達(dá)與Gli1胞核表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.361，P＜0.05);Kaplan-Meier法log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，結(jié)果顯示在MPM組織中Numb表達(dá)缺失與預(yù)后不良有關(guān)(P＜0.05);此外，病理類型中的上皮型較之于非上皮型為有利預(yù)后因素(P＜0.05)。Cox

12、回歸模型分析顯示只有病理類型為獨(dú)立的預(yù)后因素(HR=1.952，95％CI1.044，3.48P＜0.05)。
　　 二.Numb在MPM細(xì)胞株NCI-H2452中的表達(dá)及對Gli1的調(diào)控作用
　　 1.Numb在MPM細(xì)胞株NCI-H2452中的表達(dá)
　　 結(jié)果顯示NumbmRNA在NCI-H2452和293T細(xì)胞表達(dá)水平相似，但在蛋白水平，Numb在NCI-H2452細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于293T。經(jīng)蛋白酶體抑

13、制劑MG132作用后，Numb蛋白表達(dá)明顯升高，提示Numb在NCI-H2452細(xì)胞中低表達(dá)或表達(dá)缺失與轉(zhuǎn)錄后抑制有關(guān)。
　　 2.在NCI-H2452細(xì)胞中過表達(dá)Numb后Gli1蛋白表達(dá)受到抑制
　　 Numb蛋白在Numb轉(zhuǎn)染組中表達(dá)明顯高于空載體對照組，外源性表達(dá)Numb成功。Gli1mRNA在Numb轉(zhuǎn)染組和空載體對照組比較無明顯差異;而Gli1蛋白在Numb轉(zhuǎn)染組較之于空載體對照組表達(dá)降低，提示Numb抑制了

14、Gli1蛋白表達(dá)。蛋白酶體抑制劑MG132作用于Numb轉(zhuǎn)染組后，Gli1蛋白表達(dá)恢復(fù)，提示在MG132作用下Numb對Gli1蛋白抑制作用消失。
　　 三.過表達(dá)Numb對MPM細(xì)胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化療敏感性的影響
　　 1.過表達(dá)Numb后NCI-H2452細(xì)胞增殖受到抑制
　　 MTT檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染外源性Numb基因48、72h后，Numb轉(zhuǎn)染組與空載體對照組或空白對照組比較，OD值明顯降

15、低，結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)提示過表達(dá)Numb能夠抑制NCI-H2452細(xì)胞增殖活力。
　　 2.過表達(dá)Numb促進(jìn)NCI-H2452細(xì)胞的凋亡
　　 轉(zhuǎn)染外源性Numb基因72h后，Hoechst染色在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Numb轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡顯著，出現(xiàn)明顯的核固縮，核碎裂，而空載體對照組和空白對照組凋亡細(xì)胞相對較少;AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率（早期凋亡率+晚期凋

16、亡率）顯示，Numb轉(zhuǎn)染組與空載體對照組或空白對照組比較，凋亡率明顯升高，結(jié)果有顯著性差異（均P＜0.01），提示過表達(dá)Numb后，促進(jìn)NCI-H2452細(xì)胞凋亡。
　　 3.Numb通過激活caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)NCI-H2452細(xì)胞凋亡
　　 Westernblot結(jié)果顯示同空載體對照組比較，Numb轉(zhuǎn)染組細(xì)胞caspase-3，9活性蛋白和胞質(zhì)細(xì)胞色素C表達(dá)明顯升高，XIAP、survivin表

17、達(dá)減弱。提示Numb可能通過激活細(xì)胞色素C/caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)NCI-H2452細(xì)胞凋亡。
　　 4.過表達(dá)Numb增強(qiáng)NCI-H2452細(xì)胞對順鉑和卡鉑的化療敏感性。
　　 MTT檢測結(jié)果顯示在相同濃度順鉑或卡鉑作用下，Numb轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率明顯低于空載體對照組和空白對照組(P＜0.05，P＜0.01);過表達(dá)Numb對培美曲塞作用的3組細(xì)胞存活率無明顯影響。提示過表達(dá)Numb增強(qiáng)NCI-H

18、2452細(xì)胞對鉑類化療藥物的敏感性。
　　 結(jié)論：
　　 1.Numb在MPM組織中的表達(dá)減弱甚至缺失，并且與高Ki-67標(biāo)記指數(shù)及不良預(yù)后密切相關(guān)。
　　 2.Gli1在MPM組織中表達(dá)增強(qiáng)，與IMIG分期相關(guān);Numb與Gli1表達(dá)負(fù)相關(guān)，Numb可能通過泛素-蛋白酶體途徑抑制Gli1蛋白的表達(dá)。
　　 3.過表達(dá)Numb能夠抑制MPM細(xì)胞的增殖能力，并通過caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)M

19、PM細(xì)胞的凋亡。
　　 4.過表達(dá)Numb能夠增強(qiáng)MPM細(xì)胞對鉑類化療藥物的敏感性。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 1.本課題首次發(fā)現(xiàn)Numb在MPM組織中表達(dá)減弱甚至缺失，并且為預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　 2.本課題首次在MPM中研究了Numb與Gli1的相關(guān)性及Numb對Gli1的調(diào)控作用。
　　 3.本課題首次在MPM中研究了Numb對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響，為以Numb為靶點(diǎn)進(jìn)行基因