RabGTPases介導(dǎo)GOLPH3在腦膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)EGFR內(nèi)吞循環(huán)的作用機制研究.pdf

1、目的：本研究在前期發(fā)現(xiàn)GOLPH3抑制EGFR內(nèi)吞的基礎(chǔ)上，重點探討其放大EGFR信號通路促進膠質(zhì)瘤細胞增殖的具體機制，為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供潛在的靶點。
　　方法：1.在體外培養(yǎng)的U251膠質(zhì)瘤細胞中，通過LipofectamineTM-2000分別轉(zhuǎn)染GOLPH3的siRNA，應(yīng)用WB、免疫熒光法檢測下調(diào)GOLPH3的表達對EGFR的內(nèi)吞的影響。2.U251細胞中通過CoIP檢測GOLPH3是否與Rab5直接相互作用，干擾

2、GOLPH3后，WB檢測Rab5的膜蛋白及總蛋白的變化。并用GST-pulldown檢測下調(diào)GOLPH3后對Rab5的活性的影響。3.在體外培養(yǎng)的U251膠質(zhì)瘤細胞中，運用免疫熒光法在下調(diào)GOLPH3表達檢測EGFR與Rab5及Rab5與EEA1的共定位。4.U251細胞中干擾GOLPH3后，同時下調(diào)Rab5，免疫熒光法檢測對EGFR內(nèi)吞的影響。5.在U251細胞中下調(diào)GOLPH3后WB檢測Rab11的膜蛋白及總蛋白變化，免疫熒光法檢測

3、下調(diào)GOLPH3的表達對EGFR的循環(huán)的影響及EGFR與Rab11的共定位情況。
　　結(jié)果：1.在膠質(zhì)瘤細胞中，熒光示下調(diào)GOLPH3能夠促進EGFR的內(nèi)吞，并用EGF刺激5min，EGFR的膜蛋白水平均顯著降低（P＜0.01）。2.CoIP檢測GOLPH3與Rab5直接相互作用，干擾GOLPH3后，WB檢測Rab5的膜蛋白顯著降低(P＜0.01)并總蛋白的變化不明顯(P＞0.05)。并用GST-pulldown檢測下調(diào)GOLPH

4、3后明顯的增加Rab5的活性量(P＜0.01)。3.下調(diào)GOLPH3表達后，EGF刺激5min，其EGFR與Rab5及Rab5與EEA1的共定位均明顯增加（P＜0.05）。4.U251細胞中干擾GOLPH3后，同時下調(diào)Rab5，免疫熒光法示明顯的抑制了EGFR的內(nèi)吞。5.在U251細胞中下調(diào)GOLPH3后WB檢測Rab11的膜蛋白明顯減少(P＜0.05)，免疫熒光法檢測下調(diào)GOLPH3的表達明顯抑制EGFR的循環(huán)及EGFR與Rab11的