Tet1對(duì)誘導(dǎo)型重編程的影響及非整合型hiPSC誘導(dǎo)的研究.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)是指分化的體細(xì)胞在外源特定轉(zhuǎn)錄因子的作用下，可改變?cè)械募?xì)胞命運(yùn)重回多能性干細(xì)胞的狀態(tài)。有效的重編程不僅需要使細(xì)胞重建多能性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)也必須打破體細(xì)胞固有的狀態(tài)，建立胚胎干細(xì)胞特有的表觀遺傳修飾。在這一過(guò)程中，DNA的甲基化和羥甲基化被認(rèn)為發(fā)揮了重要的作用。在本文的第一項(xiàng)研究中，我們證明了DNA羥甲基化酶Tet1可通過(guò)其羥甲基化活性，加速多能基因調(diào)控區(qū)域的去甲基化進(jìn)程，激活多能性基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞多能性的建

2、立，提高誘導(dǎo)型重編程的速率和效率。此外，Tet1可取代部分Yamanaka轉(zhuǎn)錄因子建立高質(zhì)量的iPS細(xì)胞系。這些由Tet1參與建立的iPS細(xì)胞不僅高水平地表達(dá)多能性基因，更可在體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)中發(fā)育為含有三胚層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的畸胎瘤，以及具有生殖系傳遞能力的嵌合體小鼠。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)OT(Tet1取代Sox2、Klf4和c-Myc)和TSKM（Tet1取代Oct4）iPS細(xì)胞可在四倍體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中高效地產(chǎn)生足月的、完全由iPS細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的

3、all-iPSC小鼠。與OSKM-iPSC小鼠具有極高的腫瘤發(fā)生率所不同的是，這些OT-和TSKM-iPSC小鼠能夠健康地成長(zhǎng)并存活1年以上的時(shí)間。此外，我們還建立了OT和TSKM二次誘導(dǎo)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)型重編程中表觀遺傳修飾的變化提供了便利。總之，我們的研究證明了Tet1和5hmC在誘導(dǎo)型重編程中起到了十分重要的作用，Tet1可取代Yamanaka轉(zhuǎn)錄因子建立高質(zhì)量的、多能的iPS細(xì)胞。
　　傳統(tǒng)的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiP

4、SC)技術(shù)采用病毒介導(dǎo)的誘導(dǎo)方式，造成了人類(lèi)基因組中外源基因的插入。此外，以人皮膚成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的體細(xì)胞的取材具有較大的創(chuàng)傷性，不利于實(shí)際應(yīng)用的推廣。本文的第二項(xiàng)工作是對(duì)簡(jiǎn)單、快速和安全的hiPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法的研究。我們證明了僅需2-5毫升外周血單核細(xì)胞的episomal質(zhì)粒電轉(zhuǎn)，即可在一個(gè)月內(nèi)有效地建立無(wú)外源基因插入的、非整合型的hiPS細(xì)胞。我們將這些hiPS細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)動(dòng)物源性成份的體系中，并證明了它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、核心