扶正解毒方對體外誘導(dǎo)型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的干預(yù)調(diào)控作用研究.pdf

1、腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一直困擾著臨床醫(yī)生的重要課題，限制著臨床療效的提高，在這一過程中，與機體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞和因子發(fā)揮著重要作用，其中重要的細胞即為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)，在與腫瘤細胞相互作用方面，既往研究多表明，巨噬細胞是抗腫瘤免疫調(diào)控過程中的一組重要細胞群，其可以直接殺傷腫瘤細胞，或者通過遞呈腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而清除腫瘤，發(fā)揮相應(yīng)的抗腫瘤效應(yīng)。但隨著近年來

2、對腫瘤及腫瘤間質(zhì)的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)TAM并沒有發(fā)揮抗腫瘤作用，而是參與并促進了腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，其在促進腫瘤血管和淋巴管生成等方面具有十分重要的效應(yīng)。目前認為，巨噬細胞至少包括2種不同活化表型和功能特征的亞群:①經(jīng)典活化的巨噬細胞(classically activated macrophages，caMphi) M1型;②替代性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophages，aa

3、Mphi) M2型。其中M1型巨噬細胞可通過直接或間接分泌多種促炎細胞因子殺傷病原體和腫瘤細胞;而M2型巨噬細胞表現(xiàn)為較低的抗原提呈能力，并可通過分泌抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答，促進腫瘤細胞的生長和遠處轉(zhuǎn)移。M1型和M2型巨噬細胞是巨噬細胞連續(xù)活化狀態(tài)的兩個極端，根據(jù)對甲狀腺乳頭狀癌、卵巢癌和乳腺癌的研究結(jié)果，指出TAM可能發(fā)生替代性活化，TAM更偏向于M2型極化的巨噬細胞。
　　中醫(yī)藥防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作

4、用明顯，扶正解毒法是防治腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要治療法則，我科自行研制的扶正解毒口服液在臨床應(yīng)用上顯示其能有效的防治腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，我們課題的前期研究亦顯示:扶正解毒方聯(lián)合化療能有效抑制小鼠前胃癌生長，減輕荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移程度，延長生存期，改善荷瘤小鼠預(yù)后，其作用機制在于減輕腫瘤組織中CD68+巨噬細胞浸潤程度，減少M2型巨噬細胞的含量;降低血清中M2型巨噬細胞誘導(dǎo)因子及所分泌的免疫抑制因子IL-4，IL-10，IL-13，TGF-β的含

5、量;降低免疫抑制細胞（CD11b+F4/80+巨噬細胞、MDSC）在脾臟中的含量，重塑機體免疫功能?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)，我們進行了體外實驗研究，以體外活化的腫瘤相關(guān)巨噬細胞為靶點，在與腫瘤細胞MFC細胞共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，建立常氧和乏氧條件下的共培養(yǎng)模型，觀察扶正解毒方對共培養(yǎng)體系下TAM細胞表面標(biāo)記的影響，觀察扶正解毒方對共培養(yǎng)體系中IL-10等免疫抑制因子的調(diào)控作用以及對共培養(yǎng)體系下TAM相關(guān)趨化基因mRNA的干預(yù)調(diào)控作用，以進一步揭示

6、扶正解毒方調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境的分子機制。
　　目的:
　　1.闡述腫瘤相關(guān)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的作用;
　　2.揭示扶正解毒方調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境的分子機制。
　　方法:
　　1.制備大鼠空白血清和扶正解毒中藥含藥血清，作為本研究的實驗用藥;
　　2.采用LPS和IL-4對RAW264.7細胞進行體外誘導(dǎo)活化，分別誘導(dǎo)其為M1型和M2型巨噬細胞，并進行活化表型的鑒定

7、;
　　3.建立體外活化的M2型巨噬細胞與小鼠前胃癌細胞（MFC細胞）的非接觸式共培養(yǎng)體系;
　　4.運用流式細胞技術(shù)，分別在常氧和乏氧條件下檢測扶正解毒方在12h、24h、36h、48h對腫瘤相關(guān)巨噬細胞表型的影響;
　　5.運用ELISA技術(shù)，分別在常氧和乏氧條件下檢測扶正解毒方在12h、24h、36h、48h對共培養(yǎng)體系中IL-10、IL-13和TGFβ表達的影響;
　　6.運用熒光免疫PCR技術(shù)，分別在常

8、氧和乏氧條件下檢測扶正解毒方干預(yù)36h時巨噬細胞CCL22、CCL3、ArgⅠ、iNOS和HIF1-α基因mRNA表達量的情況。
　　結(jié)果:
　　1.RAW264.7細胞經(jīng)IL-4誘導(dǎo)24h后，M2型巨噬細胞標(biāo)記CD206表達較未誘導(dǎo)組明顯升高(p＜0.05)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)24h后，M1型巨噬細胞標(biāo)記CD16/32表達較IL-4誘導(dǎo)組和對照組均明顯升高(p＜0.05);誘導(dǎo)后各組M2型巨噬細胞表達量:aaMphi（IL-4誘

9、導(dǎo)）＞caMphi（LPS誘導(dǎo)）＞RAW264.7(p＜0.05);誘導(dǎo)后各組后M1型巨噬細胞標(biāo)記表達量:caMphi（LPS誘導(dǎo)）＞aaMphi（IL-4誘導(dǎo)）＞RAW264.7(p＜0.05)。
　　2.在常氧和乏氧條件下建立起M2型巨噬細胞和MFC細胞的共培養(yǎng)模型。
　　3.常氧條件下，共培養(yǎng)組別M2型巨噬細胞含量較非共培養(yǎng)組明顯升高(p＜0.05);在36h時，扶正解毒中藥血清組的M2型巨噬細胞表達量較空白血清組低，

10、但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);共培養(yǎng)組M1型巨噬細胞含量均較非共培養(yǎng)組明顯升高(p＜0.05);扶正解毒含藥血清組M1型巨噬細胞表達量均較空白血清組明顯升高(p＜0.05)。乏氧條件下，共培養(yǎng)組別M2型巨噬細胞含量較非共培養(yǎng)組明顯升高(p＜0.05);在36h和48h，扶正解毒中藥血清組的M2型巨噬細胞表達量低于空白血清組，且在48h時差異具有顯著意義(p＜0.05);共培養(yǎng)組別M1型巨噬細胞含量均較非共培養(yǎng)組明顯升高(p＜0.0

11、5);扶正解毒含藥血清組在12h、24h、36h其M1型巨噬細胞表達量均較空白血清組明顯升高(p＜0.05)。
　　4.在常氧的各時間點，扶正解毒中藥血清組的IL-10表達量均較空白血清組低，且在24h、36h、48h時差異顯著(p＜0.05)，扶正解毒中藥血清組IL-13的表達較空白血清組低，且在12h和24h時差異顯著(p＜0.05)，在常氧和乏氧條件下，扶正解毒中藥血清組TGF-β的表達均較空白血清組顯著降低(p＜0.05)

12、。
　　5.常氧條件下，共培養(yǎng)組CCL22基因表達較非共培養(yǎng)組上調(diào)，扶正解毒中藥干預(yù)后CCL22基因表達明顯下調(diào)(p＜0.05);常氧和乏氧條件下，共培養(yǎng)組CCL3、iNOS基因表達較非共培養(yǎng)組明顯下調(diào)(p＜0.05)，扶正解毒中藥干預(yù)后CCL3、iNOS基因表達則明顯上調(diào)(p＜0.05);乏氧條件下，共培養(yǎng)組ArgⅠ基因表達較非共培養(yǎng)組明顯上調(diào)(p＜0.05)，扶正解毒中藥干預(yù)后ArgⅠ基因表達明顯下調(diào)(p＜0.05)。

13、　　6.在常氧條件下，扶正解毒中藥組與空白血清組HIF1-α的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，在乏氧條件下，扶正解毒中藥組HIF1-α的表達低于空白血清組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過體外誘導(dǎo)可成功建立起M2型和M1型巨噬細胞模型，并可與MFC小鼠前胃癌細胞建立共培養(yǎng)體系;
　　2.扶正解毒方在常氧和乏氧條件下均可一定程度降低共培養(yǎng)體系中M2型巨噬細胞比例，提高共培養(yǎng)體系中M1型巨噬

14、細胞比例，促進TAM從M2型向M1型方向極化;
　　3.扶正解毒方在常氧和乏氧條件下均可降低共培養(yǎng)體系中免疫抑制因子IL-10、IL-13和TGFβ的表達量，調(diào)節(jié)腫瘤細胞局部免疫微環(huán)境;
　　4.扶正解毒方在常氧和乏氧條件下可下調(diào)共培養(yǎng)體系中M2型巨噬細胞特異性基因ArgⅠ、M2型巨噬細胞趨化基因CCL22的表達，上調(diào)M1型巨噬細胞特異性基因iNOS、M1型巨噬細胞趨化基因CCL3的表達，從腫瘤微環(huán)境中趨化基因和TAM特性性