腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌的CCL5對胃癌的作用及機制研究.pdf

1、胃癌在全球最常見的惡性腫瘤中排第四位，雖然發(fā)病率較前有所下降，但我國胃癌人數(shù)仍占全世界的42％,位居?xùn)|亞地區(qū)常見癌癥的首位。目前胃癌患者大多可選擇化學(xué)治療及行手術(shù)治療,但其5年生存率仍低于50%,導(dǎo)致其死亡的主要原因之一是癌組織的浸潤和轉(zhuǎn)移。因此，研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的具體機制，并對其進行早期預(yù)測和干預(yù)，對于制定治療方案、改善患者預(yù)后是非常有益的。
　　胃癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤相關(guān)巨噬細胞的關(guān)系日益密切，而腫瘤相關(guān)巨噬細胞

2、促進胃癌增殖、遷移及侵襲的機制目前研究較少，Wu H等報道了腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過VEGF和 VEGF-C的表達促進胃癌的血管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。一些證據(jù)表明，趨化因子及其受體在調(diào)節(jié)腫瘤局部炎癥及抑制免疫系統(tǒng)抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮一定作用，趨化因子配體5（CCL5/RANTES）屬于 CC類趨化因子家族，其受體有CCR1、CCR3和 CCR5。CCL5主要表達于T淋巴細胞、巨噬細胞、血小板、滑膜成纖維細胞、腎小管上皮細胞和一定類型的腫瘤細胞，CC

3、L5在腫瘤和炎性疾病中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人中CCL5的表達與疾病進展直接相關(guān)，另外，在宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和黑色素瘤患者的組織和血清中CCL5的表達與疾病進展具有相關(guān)性。而目前對CCL5的表達與胃癌的關(guān)系的研究尚未見報道。
　　基于上述理論，我們進行了如下研究，首先我們對比了CCL5在胃癌組織和癌旁組織及胃癌患者和健康志愿者血清中的表達差異，并對組織中CCL5和腫瘤相關(guān)巨噬細胞的標(biāo)志物CD68關(guān)

4、系進行關(guān)聯(lián)分析，同時對胃癌組織和患者血清中 CCL5的表達與胃癌的病理因素及生物學(xué)行為之間的關(guān)系進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于胃癌腫瘤間質(zhì)的TAMs高表達CCL5，而且其表達水平與胃癌的分期、預(yù)后及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此我們還利用體外細胞實驗對腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過分泌 CCL5對胃癌細胞發(fā)揮作用的具體機制進行了研究，為臨床治療胃癌提供了新的思路和靶點，對抗癌方案的設(shè)計具有非常重要的價值。
　　具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分

5、CCL5在胃癌腫瘤相關(guān)巨噬細胞中的表達及其相關(guān)性研究
　　目的：對胃癌中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）及其與 CCL5表達的相關(guān)性進行研究。
　　方法：選擇臨床病理資料完整的胃癌蠟塊標(biāo)本48例，取癌組織和癌旁組織，采用SP免疫組化法檢測CD68和CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達，并采用Spearmann相關(guān)性統(tǒng)計方法對其相關(guān)性進行統(tǒng)計。
　　結(jié)果：
　　1 CD68在胃癌組織的巨噬細胞中呈陽性表達，胞漿內(nèi)含清晰的

6、黃色或黃褐色顆粒者視為陽性。在癌旁組織中僅1例呈弱陽性表達，根據(jù)病理評分，行配對T檢驗，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），CD68的陽性表達程度與胃癌組織大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期情況、遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性（ P<0.05），與年齡、性別無相關(guān)性（P>0.05）。
　　2 CCL5在胃癌組織中呈陽性表達，胞漿內(nèi)含清晰的黃色或黃褐色顆粒者視為陽性，癌旁組織中為陰性表達。根據(jù)病理評分，行配對T檢驗，具有明顯統(tǒng)

7、計學(xué)差異（P<0.01），CCL5的陽性表達程度與胃癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期情況及腫瘤分化程度呈正相關(guān)性（P<0.05），與年齡、性別無相關(guān)性（P>0.05）。
　　3經(jīng)Spearmann相關(guān)分析，胃癌組織中CCL5與CD68的表達有顯著的相關(guān)性，且呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.759,P<0.01）。
　　結(jié)論：CD68和CCL5可能對胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移起重要的促進作用，且CCL5與CD68的表達呈明顯正相關(guān)

8、，證明CCL5的分泌可能是TAM促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一。
　　第二部分 CCL5在胃癌患者血清中的表達及臨床意義
　　目的：檢測胃癌患者血清中的CCL5表達并探討其臨床意義。
　　方法：抽取新診斷胃癌患者50例（均未行手術(shù)及放化療）及健康志愿者16例的血清標(biāo)本，采用ELISA檢測CCL5在胃癌患者及健康志愿者血清中的表達，比較兩者的表達差異，研究CCL5的表達水平與胃癌的病理因素及生物學(xué)行為之間的關(guān)系。

9、　　結(jié)果：與對照組相比，胃癌患者血清的CCL5表達水平明顯高于對照組(P<0.001)，CCL5的表達水平在患者的年齡及性別比較中無明顯差別。反之，腫瘤越大、浸潤越深、分化程度越低、伴淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的、瘤栓形成、病理分期晚的患者的血清CCL5的表達水平較腫瘤小的、浸潤淺的、分化程度高的、無淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的、無瘤栓形成的、病理分期早的患者的血清CCL5的表達水平偏高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：CCL5在胃癌患者

10、血清中高表達，血清中CCL5的表達水平與胃癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期情況及腫瘤分化程度均具有相關(guān)性，與患者的性別及年齡無相關(guān)性。
　　第三部分腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過高表達CCL5對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：觀察腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor associated-macrophages TAM)分泌的CCL5對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響，探討TAMs在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制。
　　方法：將人單核

11、細胞株THP-1體外經(jīng)IL-4誘導(dǎo)為類M2型巨噬細胞，并與胃癌細胞株AGS共培養(yǎng)形成胃癌微環(huán)境，體外細胞實驗驗證TAMs通過分泌CCL5促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，RT-PCR檢測趨化因子及其受體的表達情況，Western blot檢測Stat3信號及下游目的蛋白的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1 MTS細胞增殖實驗顯示，培養(yǎng)5天后，用IL-4誘導(dǎo)的巨噬細胞上清液培養(yǎng)的胃癌細胞增殖率為（397.57±28.82）%，高于與

12、THP-1上清共培養(yǎng)組（385.95±32.56）%和未共培養(yǎng)的胃癌細胞組（320.49±7.62）%，(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。用IL-4誘導(dǎo)的巨噬細胞上清液培養(yǎng)的胃癌細胞數(shù)量高于與 THP-1上清共培養(yǎng)組和單純胃癌細胞組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2與未共培養(yǎng)的胃癌細胞組相比，與THP-1上清共培養(yǎng)組和與THP-1上清共培養(yǎng)經(jīng) IL-4誘導(dǎo)組穿出小室的細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，經(jīng) IL-4誘導(dǎo)組胃癌細

13、胞遷移能力增強，穿出小室的細胞數(shù)多于用 THP-1上清共培養(yǎng)組(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3與未共培養(yǎng)的胃癌細胞組相比，與THP-1共培養(yǎng)組和與THP-1共培養(yǎng)經(jīng) IL-4誘導(dǎo)組的胃癌細胞的克隆形成數(shù)明顯增多(P<0.01)，分別為38.00±7.21/高倍視野和58.33±3.79/高倍視野，與THP-1共培養(yǎng)經(jīng)IL-4誘導(dǎo)組的胃癌細胞的克隆形成數(shù)較與THP-1共培養(yǎng)組明顯增多(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

14、>　　4 THP-1組、THP-1與AGS共培養(yǎng)組、THP-1與AGS共培養(yǎng)經(jīng)IL-4誘導(dǎo)組THP-1細胞中CCL2、CCL4、CCL17、CCL22的mRNA相對表達量比較無明顯差異（P>0.05），而CCL5、MMP2、MMP9mRNA的相對表達量明顯增多(P<0.01)，CCL5mRNA的表達量較MMP2和MMP9明顯增多(P<0.01)。CCL5、MMP2、MMP9mRNA的相對表達量在 THP-1與AGS共培養(yǎng)組分別為2.32

15、±0.94、1.59±0.34、1.46±0.13，THP-1與AGS共培養(yǎng)經(jīng)IL-4誘導(dǎo)組細胞中的表達分別為3.98±0.34、22.4±0.26、2.07±0.45均高于THP-1組(P<0.01)，且THP-1與AGS共培養(yǎng)經(jīng)IL-4誘導(dǎo)組中表達最多(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5與未共培養(yǎng)的胃癌細胞組相比，用THP-1上清共培養(yǎng)組和用THP-1上清共培養(yǎng)經(jīng)IL-4誘導(dǎo)組胃癌細胞表面CCL5受體CCR5mRNA的相

16、對表達量明顯增多(P<0.01)，以用 THP-1上清共培養(yǎng)經(jīng) IL-4誘導(dǎo)組的表達量最多(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6在AGS中加入不同濃度的CCL5(0μM/ml、10μM/ml、50μM/ml)，隨著 CCL5濃度的增加發(fā)生遷移的細胞數(shù)量也隨之增加，以 CCL5（50μM/ml）濃度時發(fā)生遷移的細胞數(shù)最多，達28.33±5.13/高倍視野(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7與 THP-1來源的巨噬細胞

17、共培養(yǎng)后 Stat3和 p-Stat3（p-S727和p-Y705）的表達明顯增加，高于胃癌細胞組和與THP-1共培養(yǎng)組(P<0.01)， p-Stat3（p-S727和p-Y705）的變化趨勢與Stat3呈現(xiàn)一致性（P>0.05）。
　　結(jié)論：與 THP-1來源的巨噬細胞上清共培養(yǎng)后胃癌細胞增殖和克隆形成能力增強，而且共培養(yǎng)后THP-1細胞中CCL5mRNA的表達量最高，而AGS表面CCR5mRNA相對表達量最高。隨著CCL5濃