高蛋氨酸飲食對大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞CCL5和CCR5表達(dá)的影響及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是目前發(fā)病率逐年攀升的心血管疾病至關(guān)重要的病理基礎(chǔ)，已成為一些發(fā)達(dá)國家和我國主要的死亡原因，嚴(yán)重危害著人們的健康。近年來，血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平被視為導(dǎo)致AS的一個新提出的、關(guān)鍵地非傳統(tǒng)危險因素，日趨受到人們關(guān)注，但其具體致病機(jī)制還不清楚。因此，深入探討長期高蛋氨酸（DL-Methionine，Met,又稱甲硫氨酸）飲食引發(fā)的高同型半

2、胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)所導(dǎo)致AS的機(jī)制，可以為將來臨床上通過降低血漿Hcy水平來治療AS提供理論依據(jù)和新的治療思路。
　　目的：
　　觀察長期高蛋氨酸飲食能否引起HHcy，而HHcy能否通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)CC趨化因子配體5(CC chemokine ligand5，CCL5)及其受體CCR5(chemoattractant cy

3、tokines receptor5)的變化，探討HHcy與AS的相關(guān)性及其致病機(jī)制。并觀察葉酸聯(lián)合VitB12用藥和瑞舒伐他汀對高蛋氨酸飲食引起AS的治療效果，為臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　清潔級、健康、8周齡SD雄性大鼠40只，體重180～220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后被隨機(jī)分為4組:正常對照組（10只）、高蛋氨酸(Met)飲食組（10只）、葉酸聯(lián)合VitB12治療組（10只）和瑞舒伐他汀治療組（10只）。正常對照

4、組喂食基礎(chǔ)飼料;高蛋氨酸飲食組喂食的基礎(chǔ)飼料中增加1.7％的蛋氨酸;瑞舒伐他汀治療組應(yīng)用高蛋氨酸飲食組飼料喂食4周后加用每日5mg/kg瑞舒伐他汀灌胃;葉酸聯(lián)合VitB12治療組應(yīng)用高蛋氨酸飲食組飼料喂食4周后加用每日3mg/kg葉酸和15ug/kg VitB12灌胃。
　　各組SD大鼠均按實驗設(shè)計分別喂養(yǎng)至實驗12周末，以酶法（一步終點比色法）檢驗各組大鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)濃度;用高效液相色譜方法檢驗每組大

5、鼠血漿Hcy水平;觀察蘇木素伊紅染色、油紅“O”染色后胸主動脈在光鏡下的病理學(xué)改變，并觀察電子顯微鏡下其超微結(jié)構(gòu)變化;通過免疫組化方法檢測各組大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中趨化因子CCL5及受體CCR5的蛋白表達(dá)情況;免疫組化染色后，使用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢驗各組大鼠動脈平滑肌細(xì)胞中CCL5、CCR5、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.血脂濃度每組大

6、鼠的血漿總膽固醇濃度、甘油三脂濃度均無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.血漿同型半胱氨酸(Hcy)濃度高蛋氨酸飲食組血漿Hcy含量(80.79±23.86mmol/L)明顯高于正常對照組(9.47±4.55 mmol/L，P＜0.05)和治療組(53.97±12.24 mmol/L，37.88±4.84mmol/L，P＜0.05)。兩治療組中，葉酸聯(lián)合VitB12治療組血漿Hcy值(37.88±4.84mmol/L)顯著低于瑞舒

7、伐他汀治療組(53.97±12.24 mmol/L，P＜0.05)。
　　3.大鼠胸主動脈的病理改變①HE染色（光鏡下觀察）:正常對照組胸主動脈表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)且規(guī)整，內(nèi)彈力膜基本完整，中膜平滑肌細(xì)胞無增生且排列整齊。高蛋氨酸(Met)飲食組大鼠胸主動脈的變化為其內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮細(xì)胞壞死、脫落，中膜平滑肌細(xì)胞疏松、紊亂，內(nèi)膜下有泡沫細(xì)胞形成。葉酸聯(lián)合VitB12組和瑞舒伐他汀組主動脈壁病理形態(tài)學(xué)變化介于正常對照組和高M(jìn)et飲食組之

8、間;②油紅“O”染色（光鏡下觀察）:正常對照組、葉酸聯(lián)合VitB12組和瑞舒伐他汀組胸主動脈在油紅“O”染色之后無明顯差別，未染色。高M(jìn)et飲食組局部主要表現(xiàn)為內(nèi)膜下紅染;③超微結(jié)構(gòu)觀察（電子顯微鏡下）:高M(jìn)et飲食組表現(xiàn)為胸主動脈內(nèi)膜局部損傷，可見內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)空泡增多。平滑肌細(xì)胞排列紊亂，線粒體明顯水腫，并可見較多中膜平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變。正常對照組的血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞沒有上述改變。瑞舒伐他汀組與葉酸聯(lián)合VitB12組病

9、變介于高M(jìn)et飲食組與正常對照組之間。
　　4.免疫組織化學(xué)染色血管平滑肌細(xì)胞中CCL5和CCR5蛋白的陽性表達(dá)為粗細(xì)不均勻的棕黃色顆粒，局限于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。CCL5蛋白在高M(jìn)et飲食組（139.50±15.40）的表達(dá)較強(qiáng)，顯著高于正常對照組（112.25±10.75，P＜0.05）和兩治療組(114.05±10.90，125.89±11.89，P＜0.05)，其在葉酸聯(lián)合VitB12治療組（125.89±11.89）的表達(dá)高于瑞舒

10、伐他汀治療組(114.05±10.90，P＜0.05)。CCR5蛋白在高M(jìn)et飲食組（139.12±7.71）表達(dá)較強(qiáng)，明顯強(qiáng)于正常對照組（125.41±9.93，P＜0.05）和兩個治療組（121.11±9.15，130.59±8.29，P＜0.05），在治療組中又以葉酸聯(lián)合VitB12治療組（130.59±8.29）表達(dá)較高，強(qiáng)于瑞舒伐他汀治療組(121.11±9.15，P＜0.05)。
　　5.RT-PCR CCL5 mRN

11、A在高M(jìn)et飲食組（0.93±0.02）表達(dá)高于正常對照組（0.45±0.00，P＜0.05）和治療組(0.69±0.01，0.87±0.00，P＜0.05)，在葉酸聯(lián)合VitB12組（0.87±0.00）中的表達(dá)高于瑞舒伐他汀組(0.69±0.01，P＜0.05)。CCR5 rnRNA在高M(jìn)et飲食組（1.97±0.36）表達(dá)較強(qiáng)，明顯高于正常對照組（1.02±0.04，P＜0.05）和兩個治療組（1.12±0.23，1.53±0.4

12、1，P＜0.05），在葉酸聯(lián)合VitB12治療組（1.53±0.41）中的表達(dá)高于瑞舒伐他汀治療組（1.12±0.23，P＜0.05）。NF-κB P56在高M(jìn)et飲食組（2.16±0.43）表達(dá)較強(qiáng)，明顯高于正常對照組（1.35±0.06，P＜0.05）和兩個治療組（1.39±0.18，1.73±0.26，P＜0.05），在葉酸聯(lián)合VitB12治療組(1.73±0.26）中的表達(dá)高于瑞舒伐他汀治療組(1.39±0.18，P＜0.05)