白藜蘆醇對高糖培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞P27kip1表達的影響及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種無法治愈的慢性疾病。糖尿病大血管并發(fā)癥包括高血壓、冠心病、腦血管疾病及周圍血管疾病，是糖尿病患者死亡的首要原因。與非糖尿病患者相比，糖尿病心血管疾病死亡的風(fēng)險增加3倍，腦死亡的風(fēng)險增加2倍，截肢的危險增加5倍。糖尿病并發(fā)癥最終成為糖尿病的主要問題。然而，在診斷糖尿病時，約1/4的糖尿病患者已經(jīng)存在一種或多種并發(fā)癥。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大血管并

2、發(fā)癥的基本病理改變，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)的增殖在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。
　　流行病學(xué)研究顯示，盡管法國南部居民有高脂飲食的習(xí)慣，但是因為其長期飲用富含白藜蘆醇(resveratrol，Res)的紅葡萄酒，心血管疾病的發(fā)生率和死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他有相似飲食習(xí)慣的西方國家，這就是著名的“法蘭西悖論”(French paradox)。白藜蘆醇是紅葡萄酒中含量很高

3、的一種非黃酮類多酚化合物，是植物在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種抗毒素，具有廣泛的生物和藥理學(xué)作用，包括抗氧化應(yīng)激、抗炎、心血管保護作用、降低血糖、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老及雌激素樣活性等等。白藜蘆醇可通過影響脂蛋白氧化、VSMCs增殖、血小板聚集、炎癥反應(yīng)等多種機制，對動脈粥樣硬化起到防治作用。
　　研究顯示，細(xì)胞周期素激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)p

4、27kip1可通過調(diào)控細(xì)胞周期的進程影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞周期進程受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cell cycle regulating protein，CCRP)的精密調(diào)控，包括正性調(diào)節(jié)蛋白和負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。p27kip1作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，在G1晚期減少，使細(xì)胞順利通過G1/S期限制點進入S期，完成細(xì)胞增殖。本實驗通過研究白藜蘆醇對大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞增殖、p27kip1蛋白表達的影響，探討糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)病機制及白藜蘆醇

5、的藥理作用。
　　實驗方法：
　　1.采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法：以大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞株A7r5(細(xì)胞株購自中國培養(yǎng)物典藏中心)為研究對象。將凍存的血管平滑肌細(xì)胞株迅速投入37℃溫水中，同時搖動凍存管使快速解凍，解凍后800轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基5 ml混勻，接種于培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5％CO2孵箱中孵育，待細(xì)胞鋪滿瓶底的90％后進行傳代。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于50 ml培

6、養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時，后更換于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)并同步于G0/G1期，然后分7組進行實驗：
　　①正常對照組(control)：5.5 mmol/L葡萄糖②高糖培養(yǎng)組(25 G)：25 mmol/L葡萄糖③甘露醇對照組(Mannitol)：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇④高糖+25 R組(25 G+25 Res)：25 mmol/L葡萄糖+25μmol/L白藜蘆

7、醇⑤高糖+50 R組(25 G+50 Res)：25 mmol/L葡萄糖+50μmol/L白藜蘆醇⑥高糖+100 R組(25 G+100 Res)：25 mmol/L葡萄糖+100μmol/L白藜蘆醇⑦高糖+抑制劑組(25 G+SB203580)：25 mmol/L葡萄糖+10μmol/LSB2035802.取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用MTT法檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs增殖活性的影響。
　　3.取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，

8、應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs細(xì)胞周期進程的影響。
　　4.取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs細(xì)胞p-p38MAPK、p27kip1蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.用MTT法檢測VSMCs的增殖活性，結(jié)果顯示在高糖誘導(dǎo)下，VSMCs顯著增殖(P<0.05)，而甘露醇組細(xì)胞的增殖活性無明顯改變；Res(25、50、100μmol/L)

9、可明顯抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖(P<0.05)，且呈劑量依賴性；
　　2.用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞各周期的時相分布，結(jié)果顯示高濃度葡萄糖可顯著誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化(P<0.05)，而甘露醇對照組對細(xì)胞周期進程無明顯影響；Res(25、50、100μmol/L)可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增多，S期細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)；
　　3.Western blot技術(shù)檢測

10、白藜蘆醇對VSMCs p-p38MAPK、p27kip1蛋白表達量的影響，結(jié)果顯示高糖能使磷酸化的p38MAPK蛋白表達明顯增加，p27kip1蛋白表達減少(P<0.05)；用SB203580預(yù)處理后，p38MAPK磷酸化受到抑制，p-p38MAPK蛋白表達減少，p27kip1蛋白表達增加(P<0.05)；而甘露醇組無明顯變化；Res(25、50、100μmol/L)能顯著降低p-p38MAPK蛋白的表達，增加p27kip1蛋白的表達，