白藜蘆醇對高糖培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細胞P27kip1表達的影響及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種無法治愈的慢性疾病。糖尿病大血管并發(fā)癥包括高血壓、冠心病、腦血管疾病及周圍血管疾病，是糖尿病患者死亡的首要原因。與非糖尿病患者相比，糖尿病心血管疾病死亡的風險增加3倍，腦死亡的風險增加2倍，截肢的危險增加5倍。糖尿病并發(fā)癥最終成為糖尿病的主要問題。然而，在診斷糖尿病時，約1/4的糖尿病患者已經存在一種或多種并發(fā)癥。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大血管并

2、發(fā)癥的基本病理改變，血管平滑肌細胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)的增殖在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著關鍵作用。
　　流行病學研究顯示，盡管法國南部居民有高脂飲食的習慣，但是因為其長期飲用富含白藜蘆醇(resveratrol，Res)的紅葡萄酒，心血管疾病的發(fā)生率和死亡率遠遠低于其他有相似飲食習慣的西方國家，這就是著名的“法蘭西悖論”(French paradox)。白藜蘆醇是紅葡萄酒中含量很高

3、的一種非黃酮類多酚化合物，是植物在應激狀態(tài)下產生的一種抗毒素，具有廣泛的生物和藥理學作用，包括抗氧化應激、抗炎、心血管保護作用、降低血糖、改善胰島素抵抗、調節(jié)脂質代謝、免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗衰老及雌激素樣活性等等。白藜蘆醇可通過影響脂蛋白氧化、VSMCs增殖、血小板聚集、炎癥反應等多種機制，對動脈粥樣硬化起到防治作用。
　　研究顯示，細胞周期素激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)p

4、27kip1可通過調控細胞周期的進程影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。細胞周期進程受細胞周期調節(jié)蛋白(cell cycle regulating protein，CCRP)的精密調控，包括正性調節(jié)蛋白和負性調節(jié)蛋白。p27kip1作為一種負性調節(jié)蛋白，在G1晚期減少，使細胞順利通過G1/S期限制點進入S期，完成細胞增殖。本實驗通過研究白藜蘆醇對大鼠胸主動脈平滑肌細胞增殖、p27kip1蛋白表達的影響，探討糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)病機制及白藜蘆醇

5、的藥理作用。
　　實驗方法：
　　1.采用細胞培養(yǎng)的方法：以大鼠胸主動脈平滑肌細胞株A7r5(細胞株購自中國培養(yǎng)物典藏中心)為研究對象。將凍存的血管平滑肌細胞株迅速投入37℃溫水中，同時搖動凍存管使快速解凍，解凍后800轉/min離心5min，棄上清，加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基5 ml混勻，接種于培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5％CO2孵箱中孵育，待細胞鋪滿瓶底的90％后進行傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞分別接種于50 ml培

6、養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時，后更換于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使細胞處于饑餓狀態(tài)并同步于G0/G1期，然后分7組進行實驗：
　?、僬φ战M(control)：5.5 mmol/L葡萄糖②高糖培養(yǎng)組(25 G)：25 mmol/L葡萄糖③甘露醇對照組(Mannitol)：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇④高糖+25 R組(25 G+25 Res)：25 mmol/L葡萄糖+25μmol/L白藜蘆

7、醇⑤高糖+50 R組(25 G+50 Res)：25 mmol/L葡萄糖+50μmol/L白藜蘆醇⑥高糖+100 R組(25 G+100 Res)：25 mmol/L葡萄糖+100μmol/L白藜蘆醇⑦高糖+抑制劑組(25 G+SB203580)：25 mmol/L葡萄糖+10μmol/LSB2035802.取處于對數(shù)生長期的細胞，用MTT法檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs增殖活性的影響。
　　3.取處于對數(shù)生長期的細胞，

8、應用流式細胞技術檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs細胞周期進程的影響。
　　4.取處于對數(shù)生長期的細胞，應用Western blot技術檢測不同濃度Res對高糖孵育下VSMCs細胞p-p38MAPK、p27kip1蛋白表達。
　　結果：
　　1.用MTT法檢測VSMCs的增殖活性，結果顯示在高糖誘導下，VSMCs顯著增殖(P<0.05)，而甘露醇組細胞的增殖活性無明顯改變；Res(25、50、100μmol/L)

9、可明顯抑制高濃度葡萄糖誘導的VSMCs增殖(P<0.05)，且呈劑量依賴性；
　　2.用流式細胞儀檢測細胞各周期的時相分布，結果顯示高濃度葡萄糖可顯著誘導G0/G1期細胞向S期轉化(P<0.05)，而甘露醇對照組對細胞周期進程無明顯影響；Res(25、50、100μmol/L)可顯著抑制高糖誘導的G0/G1期細胞向S期轉化，G0/G1期細胞數(shù)目增多，S期細胞數(shù)目減少(P<0.05)；
　　3.Western blot技術檢測

10、白藜蘆醇對VSMCs p-p38MAPK、p27kip1蛋白表達量的影響，結果顯示高糖能使磷酸化的p38MAPK蛋白表達明顯增加，p27kip1蛋白表達減少(P<0.05)；用SB203580預處理后，p38MAPK磷酸化受到抑制，p-p38MAPK蛋白表達減少，p27kip1蛋白表達增加(P<0.05)；而甘露醇組無明顯變化；Res(25、50、100μmol/L)能顯著降低p-p38MAPK蛋白的表達，增加p27kip1蛋白的表達，