攜帶G487T和T916C突變的白念珠菌耐藥基因表達與氟康唑耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、念珠菌屬是引起機會性真菌感染的常見病原體,也是醫(yī)院真菌感染的重要病原菌之一。近年來,由于糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、廣譜抗生素的廣泛應用,器官移植的普遍開展,導管等生物材料應用的增多,原發(fā)及繼發(fā)性免疫功能低下的人群擴大,真菌感染率呈不斷上升的趨勢。尤以白念珠菌的感染最為常見。
　　 唑類藥物是目前應用最廣的抗真菌藥物。特別是氟康唑,自從20世紀80年代后期問世以來,由于其抗菌譜廣、安全和可靜脈給藥,吸收好,毒性小等優(yōu)點,成為目前臨床

2、治療真菌感染的首選藥物。但是,隨著抗真菌藥物的廣泛使用,加之病人長時間的藥物治療和使用較低劑量的抗真菌藥物,為耐藥菌株的產(chǎn)生創(chuàng)造了條件。1980年Rosenblatt等人首次報道在應用酮康唑治療慢性皮膚念珠菌病人身上出現(xiàn)藥物耐藥現(xiàn)象。此后有關(guān)耐藥的報道越來越多。
　　 麥角固醇是真菌細胞膜中特有的脂質(zhì)。它維持著細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。14α-去甲基化酶(Erg11p)是念珠菌細胞膜麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶,ERG11是14α-

3、去甲基化酶的編碼基因。大量研究認為這個基因的點突變或過度表達均與唑類耐藥相關(guān)。ERG11的突變可以改變14α-去甲基化酶的氨基酸序列,從而影響唑類藥物與該酶的親和力,導致菌株耐藥。過度表達的外排泵基因CDR1和CDR2以及MDR1基因是第二個與耐藥相關(guān)的因為。CDR1和CDR2基因?qū)儆贏BC轉(zhuǎn)運蛋白超家族(ATP-binding cassette transporters,ABC transporters),二者的同源性超過80％,在耐

4、藥機制中可發(fā)揮協(xié)同作用。MDR1基因?qū)儆谝谆瘮U散載體超家族(major facilitator supeffamily,MFS),目前認為它的表達也與氟康唑耐藥相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)FLU1基因也與唑類耐藥相關(guān)。該基因與MDR1基因同源性較高,在耐氟康唑白念珠菌的研究中發(fā)現(xiàn)這個基因被敲除后可增加菌株對唑類藥物的敏感性。此外,生物膜形成是近年來與耐藥相關(guān)的一個新發(fā)現(xiàn)。生物膜耐藥也是導致臨床上許多系統(tǒng)性感染難以根除的重要因素。最近的研究認為細胞內(nèi)

5、液泡封閉藥物分子也可能引發(fā)菌株耐藥。
　　 耐藥的發(fā)生是一個多水平多因素參與的復雜過程。耐藥白念珠菌的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),85％的耐藥株外排泵過度表達；35％的耐藥株為藥物靶酶的氨基酸改變或過度表達；75％的耐藥株為多因素聯(lián)合耐藥。唑類藥物對念珠菌耐藥機制的研究已經(jīng)成為當今醫(yī)學研究的熱點。但國內(nèi)目前在念珠菌耐藥性方面的研究仍然較少。
　　 前期研究中我們通過測序發(fā)現(xiàn)14株臨床耐氟康唑白念珠菌的ERG11基因集中發(fā)生G487

6、T和T916C突變,且不伴隨有其他突變。目前尚未見過臨床菌株存在該突變點的報道。在白念珠菌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程中,多種機制均可在不同程度上促進菌株耐藥的形成。我們尚不清楚是否有其它耐藥機制(如MDR1、CDR1/2租FLU1)介入了這一系列臨床株的耐藥形成過程。目前也未見該方面的研究報道。該系列菌株在耐氟康唑機制中還存在其它的共同點么?耐藥相關(guān)基因的表達在這些白念珠菌中又起了什么作用呢?本課題首次對每一株攜帶G487T和T916C突變的耐

7、氟康唑白念珠菌的耐藥相關(guān)基因的表達及外排泵功能進行了研究,進一步探討該系列菌株的基因表達在氟康唑耐藥中的作用,從而為明確該系列菌株的耐氟康唑機制提供有力的實驗數(shù)據(jù),并為后續(xù)進一步研究菌株耐藥現(xiàn)象提供必要的數(shù)據(jù)分析及實驗支持。
　　 目的：
　　 1.了解攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌在不同培養(yǎng)液的生長情況,使用若丹明6G作為示蹤劑檢測該系列菌株的外排能力。
　　 2.通過實時定量PCR方法檢測攜

8、帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌多個耐藥相關(guān)基因mRNA表達水平。
　　 3.通過蛋白印跡方法檢測攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌Cdr1p和Cdr2p蛋白的表達。
　　 方法
　　 1.院內(nèi)念珠菌鑒定
　　 收集山東大學齊魯醫(yī)院檢驗科及皮膚科門診的臨床標本,包括痰液、尿液、血液及分泌物等。將標本接種于血平板,挑選可疑菌落涂片革蘭染色確認為酵母樣真菌后,轉(zhuǎn)種于改良SDA平板分

9、離純化,通過科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基鑒定,觀察結(jié)果。應用微量稀釋法和紙片擴散法測定氟康唑?qū)υ囼灳甑腗IC,確定敏感株(S)、劑量依賴敏感株(S-DD)和耐藥株(R)。微量稀釋法按照美國臨床試驗標準協(xié)會(CLSI)制定的M27-A2方案實施,ATCC6258和ATCC22019被作為質(zhì)控菌株。每次試驗重復三次。
　　 2.菌株生長及若丹明6G實驗
　　 實驗菌株:攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌14株,敏感

10、控制株ATCC102311株。將保存在SDA培養(yǎng)基的菌株經(jīng)過兩次活化,調(diào)整菌液濃度,將活化后的耐氟康唑白念珠菌分別轉(zhuǎn)入1ml RPMI1640培養(yǎng)液,1mlYEPD培養(yǎng)液和1ml64μg/ml氟康唑的YEPD培養(yǎng)液中,37℃靜置培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察耐氟康唑白念珠菌的增殖情況。
　　 使用若丹明6G作為示蹤劑,通過測定熒光強度(激發(fā)波長529nm,吸收波長553nm)來計算細胞外液若丹明的濃度,進而檢測若丹明6G在攜帶G48

11、7T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌中的外排情況。
　　 3.實時定量PCR實驗
　　 實驗菌株:氟康唑敏感白念珠菌14株(來自第一部分的收集菌株),攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌14株,敏感株ATCC102311株。根據(jù)各耐藥基因的基因序列:ERG11(GeneBank號:X13296,下同),CDR1(X77589),CDR2(U63812),MDR1(Y14703),FLU1(AF188621)

12、設計相應的引物。內(nèi)參照選用看家基因18SrRNA。標準株ATCC10231被作為敏感控制株。采用酵母RNA試劑盒分別提取各菌株RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,在LightCycler Real Time PCR擴增儀上進行實時定量PCR反應。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否為目的條帶,有無雜帶。將獲得的域值循環(huán)數(shù)(Ct值)采用2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)換為目的基因的相對表達量,檢測多個耐藥基因的表達情況,比較該系列菌株CDR1、CD

13、R2、MDR1、ERG11和FLU1基因的表達差異。
　　 4.蛋白印跡實驗
　　 實驗菌株:攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌14株,內(nèi)參照菌株Saccharomyces cerevisiae AD/CDR1和AD/CDR2。提取菌株的質(zhì)膜蛋白,BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量,通過7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,蛋白印記,ECL試劑盒顯色等步驟,檢測菌株CDR1和CDR2基因的表達情況。抗

14、Cdr1p抗體(1:500),抗Cdr2p抗體(1:1000),二抗選用HRP標記的山羊抗兔二抗(抗Cdr1p抗體1:5000；抗Cdr2p抗體1:10000)。應用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)FluorChem9900-50型進行掃描并記錄圖像,用Quantity One software軟件進行半定量分析,計算各組目的蛋白相對于內(nèi)參的相對灰度值作為各蛋白的相對含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.共收集酵母樣菌161株,在161株菌中

15、白念珠菌比例為69.57％,熱帶念珠菌為19.88％,近平滑念珠菌為4.97％,克柔念珠菌為2.48％,光滑念珠菌為1.86％,其他念珠菌為1.24％。
　　 2.在RPMI1640培養(yǎng)液中,該系列白念珠菌可形成大量菌絲;
　　 3.實時定量PCR方法顯示攜帶G487T和T916C突變的耐藥組CDR1和CDR2基因的表達明顯高于敏感組；而兩組的ERG11,MDR1和FLU1基因在mRNA表達水平上差異無統(tǒng)計學意義。

16、>　　 4.蛋白印跡實驗顯示:內(nèi)參照Saccharomyces cerevisiae AD/CDR1可以穩(wěn)定表達Cdr1p,Saccharomyces cerevisiae AD/CDR2菌株可以穩(wěn)定表達Cdr2p。在這些攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌中,所有菌株的CDR1基因均有明顯的表達,半定量分析結(jié)果示菌株J4266表達量最高。這與實時定量mRNA結(jié)果相符。但在菌株GZ16、GZ34和GZ51,無法檢測到CDR

17、2基因的完整表達。半定量分析結(jié)果示菌株J592的Cdr2p蛋白表達最高。而在實時定量PCR比較中它的mRNA表達水平要低于GZ18。這可能提示該系列菌株CDR2基因的蛋白翻譯并不是十分穩(wěn)定的。
　　 結(jié)論：
　　 1.攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌均具有主動外排若丹明6G的能力,且該能力隨著時間延長而增強,但在60min之后逐漸下降至平衡。
　　 2.氟康唑敏感白念珠菌也可具有主動外排若丹明6G

18、的能力,但該能力遠低于攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑菌株。
　　 3.主動外排泵基因CDR1和CDR2的過度表達存在于每一株攜帶G487T和T916C突變的白念珠菌。主動外排泵基因CDR1和CDR2在攜帶G487T和T916c突變的白念珠菌耐氟康唑機制中可能發(fā)揮重要作用,而易化擴散載體蛋白MDR1基因的作用可能并不明顯。
　　 4.在攜帶G487T和T916C突變的耐氟康唑白念珠菌中,CDR2基因轉(zhuǎn)錄后的蛋白翻