利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌增效作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　白念珠菌是一種條件致病性真菌。近年來(lái)，由于廣譜抗生素的大量不合理應(yīng)用、激素的濫用、腫瘤的化學(xué)治療及器官移植后免疫抑制劑的大量應(yīng)用、免疫功能低下患者不斷增多，使真菌感染發(fā)生率大大增加，其中白念珠菌感染最常見。氟康唑因其口服吸收效果好，生物利用度高，副作用小，通常作為臨床首選治療白念珠菌感染的藥物，但隨著氟康唑的大量、頻繁使用，真菌耐藥發(fā)生率逐年上升，導(dǎo)致臨床治療真菌感染的失敗。
　　本課題組前期藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利福噴丁

2、、舍曲林等聯(lián)合氟康唑時(shí)對(duì)耐氟康唑白念珠菌可能有協(xié)同作用。利福噴丁為利福霉素類抗生素，是治療結(jié)核病的一線用藥，抗結(jié)核桿菌作用比利福平強(qiáng)，且藥物不良反應(yīng)比利福平小。到目前為止，關(guān)于利福噴丁體外抗真菌協(xié)同作用的研究較少，因此，開展利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效應(yīng)研究，為臨床治療白念珠菌感染探索有效方法。
　　方法：
　　第一部分:參考M27-A2方案中的微量液基稀釋法測(cè)定利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用時(shí)對(duì)白念珠菌的最低抑菌濃

3、度(MIC);用棋盤式測(cè)定利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效應(yīng)。通過時(shí)間—生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、Spot assay實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用，并摸索后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究所需的藥物濃度。
　　第二部分:應(yīng)用透射電鏡觀察白念珠菌100分別在利福噴丁、氟康唑單藥及兩藥聯(lián)合作用前后超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　第三部分:應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白念珠菌100分別在利福噴丁、氟康唑單藥及兩藥聯(lián)合作用前后細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果

4、：
　　第一部分:利福噴丁單藥對(duì)實(shí)驗(yàn)所選12株白念珠菌均無(wú)抗菌活性(MIC80＞1024μg/mL)。在氟康唑敏感白念珠菌株中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)(FICI＞0.5);在氟康唑耐藥白念珠菌中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用(FICI＜0.1)，本試驗(yàn)所研究的菌株中，利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗白念珠菌100的增效作用最好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用該菌株作為研究對(duì)象。生長(zhǎng)曲線顯示氟康唑耐藥白念珠菌100在4～12h為生

5、長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，之后進(jìn)入生長(zhǎng)的穩(wěn)定期和衰退期。與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，單用藥組對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌100生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，合藥組顯示出明顯的抑制作用。利福噴丁(125ug/mL)與不同藥物濃度的氟康唑(4、16、64ug/mL)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)白念珠菌100的抑制作用不隨著氟康唑劑量的增加而增強(qiáng);不同藥物濃度的利福噴丁(15.63、31.25、125ug/mL)與氟康唑(4ug/mL)合用時(shí)，利福噴丁濃度越高，對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌100的抑制作用越

6、強(qiáng)。
　　第二部分:透射電鏡結(jié)果顯示生長(zhǎng)對(duì)照組的菌體形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞壁光滑，胞膜結(jié)構(gòu)連續(xù)，清晰可見，胞核及線粒體正常;利福噴丁組細(xì)胞形態(tài)基本正常，邊界清楚，部分細(xì)胞見胞核腫脹不規(guī)則，未見明顯空泡液泡;氟康唑組大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)基本正常，部分細(xì)胞胞壁電子密度不均勻分布，透明層局灶性增厚，胞膜粗糙，可見腫脹的線粒體，核質(zhì)相對(duì)分明，可見少量空泡、液泡;聯(lián)合用藥組大部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞壁的電子透明層厚薄不

7、一，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁分離，層次不清，邊界模糊，胞膜嚴(yán)重缺損，線粒體腫脹，核質(zhì)界限不清，許多大小不等的團(tuán)塊狀物質(zhì)聚集于細(xì)胞膜附近，核膜斷裂、溶解消失，胞核集聚不規(guī)則，凝聚成團(tuán)。
　　第三部分:通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用12h、24h對(duì)耐氟康唑白念珠菌100細(xì)胞周期各期DNA含量變化。作用12h時(shí)，空白對(duì)照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:(76.41±1.52)％、（75.48±1.41）％、（72.

8、36±1.01）％、（8.11±0.22）％，S期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:（5.46±0.73）％、（8.46±0.23）％、（6.86±0.56）％、（12.52±0.54）％，G2/M期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:（18.14±1.11）％、（16.06±1.37）％、（20.78±1.48）％、（79.37±0.52）％;作用24h時(shí)，空白對(duì)照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:(82.36±1.25)％、

9、（70.52±3.11）％、（60.45±1.07）％、（8.11±0.22）％，S期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:（6.03±0.92）％、（12.15±1.92）％、（15.19±1.23）％、（7.79±1.45）％，G2/M期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為:（11.61±0.86）％、（17.33±1.32）％、（24.36±0.40）％、（86.26±0.94）％，兩藥合用組比生長(zhǎng)對(duì)照組及單用藥組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少(p＜0.01)，G2

10、/M期細(xì)胞數(shù)顯著增多(p＜0.01)，表明聯(lián)合用藥組細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，通過對(duì)12h、24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，藥物對(duì)白念珠菌100細(xì)胞周期的影響大體一致。
　　結(jié)論：
　　利福噴丁單用時(shí)無(wú)抗白念珠菌活性，但利福噴丁能顯著增強(qiáng)氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性，說明利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌具有增效作用。通過透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)推測(cè)，利福噴丁可能影響RNA或DNA的合成，也可能直接抑制真菌細(xì)胞膜上的某種酶的活

11、性，從而發(fā)揮其對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩藥合用時(shí)可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制真菌細(xì)胞的正常分裂增殖。本課題組首次發(fā)現(xiàn)利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗氟康唑耐藥白念珠菌具有增效作用，聯(lián)合用藥時(shí)抗真菌作用機(jī)制比較復(fù)雜，本階段實(shí)驗(yàn)初步探索了利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用機(jī)制，本課題組將在后續(xù)研究中通過檢測(cè)胞膜甾醇含量、胞內(nèi)藥物含量及相關(guān)基因表達(dá)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索利福噴丁對(duì)氟康唑抗耐藥白念珠菌增效作用機(jī)制