白念珠菌新型耐藥基因MXR1面朝藥機(jī)制的研究.pdf

1、白念珠菌由于具有高適應(yīng)性和高耐藥性，因此易于感染而難以防治。近年來，國際上有大量關(guān)于白念珠菌適應(yīng)氧化應(yīng)激機(jī)制的研究，并有大量文獻(xiàn)提示，白念珠菌氧化應(yīng)激機(jī)制可能與其對唑類藥物的耐藥性有關(guān)。因此，白念珠菌氧化應(yīng)激對于全面闡述其耐藥機(jī)制有著十分重要的意義。
　　 研究目的通過基因敲除的方法，構(gòu)建MXR1基因缺失菌株，從而研究MXR1基因缺失后對菌株生長、藥物敏感性、對H2O2的耐受能力、細(xì)胞內(nèi)活性氧、谷胱甘肽還原體系、線粒體膜電位、氧

2、化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)、CDR1等重要的耐藥基因表達(dá)、菌絲形成、羅丹明外排及滲透敏感性的變化。
　　 研究方法1.構(gòu)建基因敲除載體質(zhì)粒:利用PCR、雙酶切及DNA連接法，構(gòu)建MXR1基因敲除載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒是以p5921質(zhì)粒為基礎(chǔ)，含有MXR1基因ORF兩側(cè)的上下游片段及hisG-Ura3-HisG片段。構(gòu)建后分別采用PCR、雙酶切和測序鑒定法，鑒定每一步的陽性質(zhì)粒。2.構(gòu)建基因缺失菌:通過URA-Blaster法構(gòu)建MXR1基因缺

3、失菌株，每一步采用PCR鑒定，最后的陽性菌株采用Southern-blot鑒定。3.生長曲線:將野生菌與MXR1基因缺失菌株，等濃度培養(yǎng)，在不同的時間點測量各菌株的OD600值，從而得到各株菌的生長曲線。4.MXR1基因缺失菌對藥物敏感性的實驗:通過MIC80和Spot-assay實驗，研究MXR1基因缺失菌對藥物敏感性的變化。5.MXR1基因缺失菌對H2O2耐藥力的實驗:通過H2O2液基搖培實驗、Spot-assay實驗，研究MXR1

4、基因缺失菌對H2O2耐藥力的變化。6.細(xì)胞內(nèi)活性氧——ROS含量的測定:將2，7-二氫二氯熒光素二乙酯——DCFH-DA與菌株共培養(yǎng)，在不同時間測定熒光值，從而測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量。7.氧化型和還原型谷胱甘肽含量測定:通過谷胱甘肽還原酶及總谷胱甘肽檢測試劑盒測定氧化型和還原型谷胱甘肽含量。8.線粒體膜電位測定:通過線粒體膜電位試劑盒測定線粒體膜電位。9.通過Real-time RT-PCR法，測定氧化應(yīng)激相關(guān)基因SOD2、T

5、RR1、GLR1表達(dá)情況。10.通過Real-time RT-PCR法，測定重要耐藥相關(guān)基因CDR1、CDR2、MDR1、ERG11表達(dá)情況。11.在含有小牛血清(FBS)、Lee's、Spider的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以觀察MXR1基因缺失對菌絲形成的影響。12.羅丹明6G外排實驗:在菌株中加入羅丹明6G測定菌株的主動轉(zhuǎn)運功能。13.MXR1基因缺失對白念珠菌滲透刺激敏感性的影響:通過Spot-assay實驗，觀察菌株對于SDS、CaCl2、

6、LiCl的滲透刺激敏感性的改變。
　　 結(jié)果1.本研究首先構(gòu)建了MXR1基因敲除載體質(zhì)粒，并采用Ura-blaster方法將白念珠菌中的MXR1基因敲除，從而進(jìn)行后續(xù)的表型分析，進(jìn)而獲得該基因功能的相關(guān)信息。2.本研究考察了MXR1基因?qū)τ诎啄钪榫哪退幮缘挠绊?。MXR1基因缺失后，菌株對唑類藥物敏感性明顯上升，對丙烯胺類及多烯類藥物敏感性無明顯變化。3.本研究考察了MXR1基因?qū)τ诎啄钪榫?xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激機(jī)制的影響。MXR1基因

7、缺失后，(1)菌株對H2O2的耐受能力下降;(2)細(xì)胞內(nèi)活性氧——ROS水平升高;(3)線粒體膜電位——△ψm增高;(4)某些與氧化還原相關(guān)基因（如SOD2等）表達(dá)無明顯變化;(5)細(xì)胞內(nèi)還原型GSH/氧化型GSSG的比值無明顯變化。上述結(jié)果提示，MXR1基因在白念珠菌細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制中可能起到作用。4.MXR1基因缺失后:(1)菌株中CDR1、MDR1的表達(dá)略有上升，(2)而CDR2、ERG11表達(dá)無明顯變化;(3) MXR1基因缺

8、失對于白念珠菌菌絲的形成無明顯的影響;(4) MXR1基因缺失不影響白念珠菌的滲透敏感性。
　　 結(jié)論白念珠菌的MXR1基因缺失后，對于H2O2的耐受力顯著下降，說明MXR1基因可能參與了白念珠菌的氧化應(yīng)激體系，導(dǎo)致白念抗氧化的能力下降。后來我們又發(fā)現(xiàn)，MXR1基因敲除后，白念珠菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)明顯升高，本研究首次證實了MXR1基因可減少對ROS的清除。ROS產(chǎn)生的主要部位位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，目前國際上通常用線粒體膜電位作

9、為測試線粒體功能的重要指標(biāo)。由于ROS受MXR1基因的影響，我們進(jìn)一步考慮MXR1的敲除對于△ψm的影響。結(jié)果表明在MXR1基因缺失后，白念珠菌的△ψm顯著升高。說明白念珠菌對于H2O2的耐受力顯著下降，可能是由于ROS升高、線粒體膜電位升高引起的，因此我們推測，MXR1基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激的影響，可能是通過升高線粒體膜電位，并減少對ROS清除而完成的。另外，我們也發(fā)現(xiàn)，MXR1基因缺失不改變谷胱甘肽還原體系及氧化應(yīng)激體系中的某些重要基因，如

10、谷胱甘肽還原酶基因——GLR1、錳-超氧化物歧化酶基因——SOD2和硫氧還蛋白還原酶基因——TRR1的表達(dá)，通過本研究中實時定量RT-PCR顯示，這三個基因在MXR1敲除前后表達(dá)無明顯改變。這兩個實驗說明，MXR1基因缺失菌對于氧化應(yīng)激的影響，可能不通過這些已知的氧化還原相關(guān)基因完成。MXR1參與了白念珠菌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:與親本菌株RM1000相比較，MXR1基因敲除菌中CDR1及MDR

11、1基因表達(dá)略有上升，但是CDR2及ERG11基因的表達(dá)無明顯變化。因此我們采用檢測熒光染料羅丹明6G的含量的方法，來檢測白念珠菌的外排功能。親本菌和MXR1基因缺失菌對羅丹明6G熒光外排沒有明顯差異，這與之前的Real-time RT-PCR結(jié)果中MXR1基因敲除菌CDR1表達(dá)略有上升產(chǎn)生矛盾，我們分析可能是由于CDR1基因表達(dá)水平僅上升了2.5倍，而后期編碼翻譯的過程沒有明顯變化有關(guān)。另外我們研究了MXR1基因缺失后菌絲的形成和滲透刺

12、激敏感性的變化，結(jié)果表明，MXR1基因缺失對這兩者沒有明顯的影響。文獻(xiàn)報道唑類藥物除了有已知的抑制麥角固醇的生物合成機(jī)制外，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量從而達(dá)到抑菌作用也是咪康唑抑制白念珠菌生長的重要機(jī)制;抗氧化劑可以顯著減弱咪康唑的抑菌作用，細(xì)胞內(nèi)活性氧與唑類耐藥機(jī)制有著密不可分的關(guān)系，而白念珠菌細(xì)胞內(nèi)，對于ROS的清除增多可能與其對唑類的耐藥有關(guān)。我們分別證明了MXR1基因缺失可導(dǎo)致菌株對唑類藥物的敏感性增加，同時菌株內(nèi)的ROS增加。結(jié)合