白念珠菌鐵穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、白念珠菌是人體最常見的一種條件致病性真菌，能夠以共生和致病兩種狀態(tài)存在于宿主微環(huán)境內(nèi)。通常情況下，白念珠菌廣泛存在于自然界及人體皮膚、口腔、生殖道及胃腸道粘膜表面，當機體免疫機能下降或正常寄居部位微生境失調(diào)時，容易引起淺層皮膚粘膜感染或者侵襲性感染，甚至危及生命。隨著白念珠菌比較基因組學和功能基因組學的快速發(fā)展，對白念珠菌的致病機理和耐藥機制的研究取得了較大進展，鑒定和闡述了多個重要毒力決定因素，包括酵母型-菌絲型形態(tài)轉(zhuǎn)換、white-

2、opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換、對宿主細胞的粘附和侵襲、胞外水解酶的分泌、生物膜的形成、pH感應(yīng)和調(diào)控能力、接觸感應(yīng)、向觸性生長和環(huán)境壓力應(yīng)答能力等，其中許多細胞應(yīng)答過程與胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。
　　鐵是絕大部分生物體必需的基本營養(yǎng)元素，能夠作為調(diào)控信號刺激生物體對外界環(huán)境作出應(yīng)答。一方面，從外環(huán)境中攝取鐵的能力是白念珠菌在宿主中定殖、存活和致病過程的重要影響因素;另一方面，胞內(nèi)過量鐵離子也容易通過芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基等活性氧簇，對細胞產(chǎn)生

3、毒害作用。因此，白念珠菌逐漸進化出一系列嚴謹?shù)蔫F離子獲得、儲存、轉(zhuǎn)運和調(diào)控系統(tǒng)來維持胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，避免鐵離子濃度波動對細胞產(chǎn)生損傷。近年來，關(guān)于白念珠菌胞外鐵離子獲得系統(tǒng)的研究取得了較大的進展，許多鐵離子獲得相關(guān)基因的生物學功能已逐漸得到闡釋，但是白念珠菌胞內(nèi)鐵離子儲存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究仍處于空白階段。此外，盡管本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Aft2轉(zhuǎn)錄因子具有潛在的鐵應(yīng)答調(diào)控效應(yīng)，但對其調(diào)控機理及參與的代謝過程尚不清楚。本研究針對以上幾個問題，鑒定并

4、闡釋了白念珠菌胞內(nèi)鐵離子儲存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和Aft2轉(zhuǎn)錄因子介導的鐵應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng)，同時探究其在白念珠菌壓力應(yīng)答、形態(tài)發(fā)生和致病過程中的重要作用，為臨床上治療白念珠菌感染和新型抗真菌藥物開發(fā)提供重要的參考價值。本研究主要結(jié)果如下:
　　(1)采用生物信息學和分子細胞生物學方法，在白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中檢索并鑒定出線粒體膜轉(zhuǎn)運蛋白Mrs4、液泡膜轉(zhuǎn)運蛋白Ccc1和液泡膜轉(zhuǎn)運蛋白Smf3。研究發(fā)現(xiàn)，Mrs4蛋白屬于線粒體轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，定位

5、于線粒體膜上，在維持線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)線粒體鐵轉(zhuǎn)運方面中發(fā)揮著重要作用。Ccc1蛋白主要負責向液泡中轉(zhuǎn)運鐵，而Smf3蛋白主要負責將液泡中儲存鐵釋放到胞質(zhì)中。三種轉(zhuǎn)運蛋白能夠形成Mrs4-Ccc1-Smf3(MCS)途徑，協(xié)同調(diào)控白念珠菌胞內(nèi)鐵離子的分配和轉(zhuǎn)運，在胞內(nèi)鐵應(yīng)答和利用等代謝過程中發(fā)揮著重要作用。
　　(2)采用PCR介導的同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了mrs4Δ/Δ、ccc1Δ/Δ、smf3Δ/Δ單基因缺失菌株和mrs4Δ

6、/Δsmf3Δ/Δ、mrs4Δ/Δccc1Δ/Δ雙基因缺失菌株。研究發(fā)現(xiàn)，MRS4基因的缺失會擾亂白念珠菌胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)，提高細胞膜鐵獲得相關(guān)基因的表達水平，降低線粒體鐵利用相關(guān)基因的表達水平，從而增強細胞從胞外環(huán)境中獲得鐵的能力，并最終導致胞內(nèi)鐵含量水平的升高。在mrs4Δ/Δ缺失菌株基礎(chǔ)上進一步敲除液泡鐵轉(zhuǎn)出蛋白Smf3后，會進一步加重胞內(nèi)鐵含量水平的積累，而在mrs4Δ/Δ缺失菌株基礎(chǔ)上進一步敲除液泡鐵轉(zhuǎn)入蛋白Ccc1后，能顯著降

7、低胞內(nèi)鐵含量水平，使其恢復(fù)至野生型水平。此外，MCS途徑在白念珠菌適應(yīng)性生長、低鐵和高鐵應(yīng)答、離子穩(wěn)態(tài)、氧化脅迫、線粒體呼吸、鐵硫簇合成、mtDNA穩(wěn)定性、線粒體膜電勢穩(wěn)定性、細胞壁完整性、抗真菌藥物耐受性、形態(tài)轉(zhuǎn)換、上皮細胞粘附侵染和毒力等細胞過程中發(fā)揮著重要作用。上述結(jié)果提示，MCS途徑能維持胞內(nèi)鐵離子的穩(wěn)態(tài)，可能作用機理:MCS途徑協(xié)同調(diào)控胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)過程，Mrs4負責向線粒體中轉(zhuǎn)入鐵以供細胞利用，Ccc1負責向液泡中轉(zhuǎn)入鐵以供細胞

8、儲存，而Smf3負責將液泡中鐵活化釋放至胞質(zhì)中。胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的破壞會嚴重削弱菌株應(yīng)答外界環(huán)境信號的能力，并導致線粒體功能的失調(diào)，從而引發(fā)一系列的相互作用的損傷，影響許多重要的細胞過程，如細胞壁完整性、抗真菌藥物耐受性、形態(tài)發(fā)生和毒力等。
　　(3)白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子在維持胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)過程中具有重要作用。采用原子吸收光譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AFT2基因的缺失會降低菌株在低鐵條件下胞內(nèi)鐵含量水平。Rea1-Time PCR結(jié)果顯示，Aft

9、2是一種低鐵應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，具有雙重調(diào)控作用，既能作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進FTR1、FET3、FRP1、CFL1和FET34等鐵代謝基因表達，也能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子阻遏MRS4、SIT1、SMF3和HAP43等鐵代謝基因的表達。通過定點突變技術(shù)和構(gòu)建LacZ報告質(zhì)粒方法，研究發(fā)現(xiàn)Aft2轉(zhuǎn)錄因子能夠以基因劑量依賴的方式，通過CACCC保守應(yīng)答元件負向調(diào)控MRS4鐵應(yīng)答基因的表達，從分子水平上初步揭示了Aft2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵代謝基因表達的可能機理

10、。蛋白定位實驗表明，在低鐵條件下，白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子能夠從胞漿轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，從細胞水平上提供了Aft2轉(zhuǎn)錄因子參與鐵代謝基因表達調(diào)控的又一證據(jù)。
　　(4)除參與調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)過程外，白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子在環(huán)境壓力應(yīng)答及形態(tài)發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Aft2轉(zhuǎn)錄因子以非鐵依賴性機制參與氧化壓力應(yīng)答過程。在氧化壓力條件下，AFT2基因的缺失導致胞內(nèi)ROS的聚集，并誘導SOD酶活性，提示生長缺陷可能是由于胞內(nèi)ROS

11、過度聚集而無法有效清除造成的。采用絮凝實驗、疏水性測定以及粘附能力測定實驗，發(fā)現(xiàn)AFT2基因的缺失影響白念珠菌細胞表面特性，不僅會引起菌株絮凝能力的增強，同時也增強菌株細胞表面的疏水性以及對聚苯乙烯等材料的吸附能力。菌絲誘導實驗表明，Aft2轉(zhuǎn)錄因子既能作為正向調(diào)控因子參與固體誘導條件下的瓊脂侵入和形態(tài)發(fā)生過程，也能作為負向調(diào)控因子參與液體誘導條件下的形態(tài)發(fā)生過程。菌絲誘導信號能夠上調(diào)白念珠菌AFT2基因mRNA和蛋白表達水平，也能引起

12、Aft2蛋白細胞學定位的改變，使其細胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)并聚集，為發(fā)揮調(diào)控作用提供必要條件。在嵌入應(yīng)答過程中，Aft2轉(zhuǎn)錄因子主要作為Czf1途徑的下游組分參與激活應(yīng)答過程，Efg1主要作為負向調(diào)控因子抑制Czf1和Aft2的激活活性。免疫共沉淀實驗揭示，在YPD正常條件下，Efg1蛋白和Czf1蛋白都能和Aft2蛋白具有物理性相互作用，當誘導信號出現(xiàn)時，Czf1與Aft2蛋白仍然保持相互作用而Efg1與Aft2蛋白間相互作用出現(xiàn)解離