協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的小分子化合物設(shè)計(jì)、合成、生物活性和作用機(jī)制研究.pdf

1、真菌耐藥的情況日益嚴(yán)重，尤其是念珠菌屬，對各類抗真菌藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，如唑類藥物、多烯類藥物和棘白菌素類藥物。而且其耐藥機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。侵襲性真菌感染在全球的發(fā)病率急劇上升，日益嚴(yán)重的真菌耐藥性被公認(rèn)為導(dǎo)致免疫缺陷病人侵襲性真菌感染的發(fā)病率和死亡率逐年升高的主要原因之一。其嚴(yán)重威脅到廣大人民群眾的健康安全，為建設(shè)健康中國，如何解決真菌耐藥問題，研究出新型抗耐藥真菌藥物成為當(dāng)務(wù)之急，同時(shí)有必要深入探索機(jī)會(huì)性真菌的耐藥機(jī)制，為開發(fā)抗

2、真菌新藥提供新的靶點(diǎn)。
　　小檗堿、連翹酯苷A和黃芩素等天然產(chǎn)物已被發(fā)現(xiàn)可以作為抗耐藥白念珠的增效劑。國內(nèi)外也有報(bào)道鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、5α-還原酶抑制劑和熱休克蛋白90抑制劑等也可協(xié)同唑類藥物抗耐藥真菌。雖然已有大量不同種類的化合物已被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道具有協(xié)同抗真菌藥物抗耐藥真菌的活性，然而目前為止鮮有藥物作為抗耐藥真菌的增效劑上市，甚至于進(jìn)入臨床研究的都是寥寥無幾。大量目前已報(bào)到的增效劑具有協(xié)同抗耐藥真菌的活性MIC值一般在1.0μg

3、/ml，而小于0.1μg/ml的增效劑是不常見的。增效劑活性不夠好，可能為其原因一。至今為止，如小檗堿、連翹酯苷A和黃芩素等天然產(chǎn)物沒有形成其作用機(jī)制清晰的結(jié)論，更沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的生物大分子，可能為其原因二
　　在之前的研究中發(fā)現(xiàn)小檗堿具有協(xié)同F(xiàn)LC抗耐藥真菌的作用，并對其進(jìn)行改造獲得幾類結(jié)構(gòu)更為簡化，活性與小檗堿相當(dāng)或略優(yōu)于小檗堿的化合物。在這個(gè)研究基礎(chǔ)上，挑選出本課題組已發(fā)現(xiàn)的活性最優(yōu)的兩個(gè)小分子作為先導(dǎo)化合物1-1和先導(dǎo)化合物

4、1-2。并對其進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)改造，分別對其左側(cè)的胡椒基，中間的酰胺鍵，右側(cè)的芳環(huán)和柔鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過體外活性篩選實(shí)驗(yàn)，采用微量稀釋法和棋盤式微量稀釋法獲得化合物的活性數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，具有協(xié)同抗耐藥白念珠菌活性的的化合物有99個(gè)。與8.0μg/ml氟康唑合用時(shí)，MIC80小于0.1μg/ml的化合物有10個(gè)分別為化合物F2，F(xiàn)6，F(xiàn)8，F(xiàn)13，F(xiàn)14，F(xiàn)21，G8，G9，G10和G15，其中化合物F2、F6和F8采用棋盤式微量稀釋

5、法進(jìn)一步證實(shí)其活性數(shù)據(jù)的可靠性。這類化合物的構(gòu)效關(guān)系表明，其中先導(dǎo)化合物1-1中的胡椒基是其發(fā)揮生物活性的重要部分，酰胺鍵也是必不可少的部分，將酰胺鍵轉(zhuǎn)變?yōu)槟骢０锋I可以略微提高其生物活性，將苯環(huán)替換成對位聯(lián)苯結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步提高其生物活性，將聯(lián)苯結(jié)構(gòu)中的一個(gè)苯環(huán)替換成噻吩環(huán)，可以保持與聯(lián)苯類化合物相當(dāng)?shù)幕钚?，另外?dāng)柔鏈長度為5-6個(gè)碳為最佳。
　　由此，選擇活性最優(yōu)的化合物F6（CZ-66）對其進(jìn)行抗耐藥白念珠菌機(jī)制研究，對耐藥菌1

6、03的ROS實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LC、F5(CZ-65)單用不能引起ROS升高，F(xiàn)5(CZ-65)與FLC聯(lián)用ROS升高約3倍，F(xiàn)6(CZ-66)單用ROS升高約10倍，F(xiàn)6(CZ-66)與FLC聯(lián)用ROS升高約26倍。結(jié)果表明化合物F6(CZ-66)單用和聯(lián)用FLC都能顯著提高ROS水平，然而結(jié)構(gòu)與其相似的化合物F5(CZ-65)單用時(shí)并未能提高ROS水平。對耐藥菌103的羅丹明外排實(shí)驗(yàn)中，加入葡萄糖(2mM)后，羅丹明6G外排增強(qiáng)，且隨著時(shí)間

7、延長而增長。各用藥組羅丹明6G外排與對照組無明顯差異，說明化合物F5(CZ-65)、F6(CZ-66)、FLC及聯(lián)用藥對耐藥菌103熒光蛋白外排無影響。CT-LINK反向分子對接找靶，通過PDB數(shù)據(jù)庫檢索，經(jīng)分析CT-LINK中獲取的可能靶點(diǎn)，只有Mitogen-activated protein kinase，NADH-ubiquinone oxidoreductase chain1和Mothers against decapenta

8、plegic homolog3在真菌中是有報(bào)道存在的。結(jié)合已報(bào)道的相關(guān)參考文獻(xiàn)，本文推測F6(CZ-66)可能作用于ROS-MAPK通路。另外本課題挑選了靶點(diǎn)相對明確的HSP90抑制劑BIIB021作為先導(dǎo)化合物2-1。對其嘌呤環(huán)上的2位、6位和9位分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，當(dāng)保留先導(dǎo)化合物9位取代基，在2位和6位上進(jìn)行簡單改造，2位和6位分別以氯或者氨基做為取代基時(shí)，對化合物的活性影響并不大。如化合物H1-H3的MIC80均為4.0-8.0μ