雙聯(lián)芐化合物riccardin D抗念珠菌生物被膜研究.pdf

1、近年來(lái)，由于多種高效、廣譜抗菌藥物的大量使用，器官移植工作的廣泛開展，激素及免疫抑制劑的應(yīng)用，血液惡性腫瘤患者中抗腫瘤藥物的應(yīng)用，各種人工植入性方法的操作，如人造關(guān)節(jié)、心臟瓣膜置換、中心靜脈插管等，真菌感染的發(fā)病率呈逐年增多的趨勢(shì)。同時(shí)，藥物的選擇性壓力迫使微生物產(chǎn)生了多種耐藥機(jī)制以保證物種的延續(xù)，其中，微生物產(chǎn)生生物被膜(biofilm)就是一種重要的耐藥機(jī)制。植入性器材，比如各種人工假體、血管內(nèi)插管等常常發(fā)生真菌生物被膜感染。微生物

2、形成生物被膜之后，耐藥性可發(fā)生極為顯著的變化，如白色念珠菌(Candida albicans)形成生物被膜之后，對(duì)氟康唑的耐藥性成倍增加。如何防治和克服C.albicans生物被膜耐藥問(wèn)題，已成為臨床上極具挑戰(zhàn)性的課題。
　　 天然藥物仍然是治療多種疾病的重要來(lái)源。苔蘚類植物作為傳統(tǒng)藥用植物，被應(yīng)用于多種疾病的治療，如心血管疾病、支氣管炎、皮膚病等，近年來(lái)，植物學(xué)家從苔蘚植物中分離了大量結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的萜類和芳香族化合物，其

3、中許多可作為新藥研究的優(yōu)良先導(dǎo)化合物。苔蘚類中的地錢屬植物為葉狀體苔類，從中分離獲得的大環(huán)雙聯(lián)芐類化合物具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗細(xì)菌和細(xì)胞毒活性等，具有極高的研究?jī)r(jià)值。Riccardin D(RCD)是從地錢(Marchantia polymorpha L.(Marchantiaceae))中分離得到的一種大環(huán)雙聯(lián)芐類化合物，結(jié)構(gòu)上以C6-C2-C6為母核，通過(guò)C-O-C醚橋和(/或)C-C鍵連接而成。進(jìn)一步的

4、研究發(fā)現(xiàn)，RCD不僅具有抗C.albicans的作用，而且對(duì)于C.albicans于體外形成的生物被膜有一定抑制作用，分子機(jī)制研究提示，RCD的抗C.albicans生物被膜活性是通過(guò)阻礙菌絲形成而實(shí)現(xiàn)的。RCD對(duì)于C.albicans生物被膜的清除能力、藥敏特性，及與其他抗真菌藥物聯(lián)用時(shí)是否具協(xié)同作用，對(duì)于體內(nèi)形成的生物被膜作用如何，尚需進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。
　　 本課題應(yīng)用C.albicans生物被膜感染的體外和體內(nèi)模型，觀察

5、了被膜形成不同階段的形態(tài)學(xué)特征。應(yīng)用此模型，研究了念珠菌在形成生物被膜前后對(duì)于實(shí)驗(yàn)藥物RCD單用或與其他抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的藥敏性質(zhì)特征，比較不同方法用于藥敏試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)的適宜性；采用“抗生素封管”給藥方法，利用生物被膜體內(nèi)外模型進(jìn)行RCD藥效學(xué)研究，包括藥物單用及與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗念珠菌效果，應(yīng)用平板計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)試驗(yàn)藥物對(duì)于體內(nèi)念珠菌被膜的抑制作用，并采用掃描電鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡等方法觀察藥物作用前后生物被膜的形態(tài)學(xué)改變；選

6、擇菌體黏附與菌絲生長(zhǎng)相關(guān)基因，制備相應(yīng)的引物和探針，采用RT-PCR法，考察RCD作用前后有關(guān)基因表達(dá)的變化，推測(cè)RCD抑制念珠菌被膜生長(zhǎng)的分子學(xué)機(jī)制。
　　 課題首先構(gòu)建了體外載體材料附著生物被膜模型和體內(nèi)中心靜脈插管相關(guān)性C.albicans生物被膜感染動(dòng)物模型，研究了被膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、被膜生長(zhǎng)的影響因素與微觀形態(tài)學(xué)特征。在被膜生長(zhǎng)前期，菌細(xì)胞的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增多，被膜形成24 h時(shí)，菌落計(jì)數(shù)達(dá)109CFU，之后生長(zhǎng)

7、較前趨于緩慢。被膜生長(zhǎng)與菌種和所黏附材料表面特性有關(guān)。其微觀形態(tài)因生長(zhǎng)階段的不同而有明顯不同，主要表現(xiàn)在菌體黏附量的多少、菌絲與假菌絲形成及胞外基質(zhì)等方面的差異。
　　 課題同時(shí)研究了C.albicans不同菌株ATCC10231、SC5314、YEM30和CA10在形成被膜前后對(duì)于試驗(yàn)藥物RCD的敏感性，被膜形成之后，其耐藥性增加，增加程度與菌種有關(guān)。當(dāng)RCD與抗真菌藥物氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈分別聯(lián)用時(shí)，對(duì)于各試驗(yàn)菌株形

8、成生物被膜前后有不同程度的增敏作用。藥物聯(lián)用效果以兩種方法評(píng)價(jià)，分別是基于LA理論的FICI法和基于BI理論的△E法，兩種方法評(píng)價(jià)藥物抗游離菌作用的結(jié)果相符率為75％。
　　 采用抗菌藥物封鎖試驗(yàn)方法，將不同濃度(8，16，32，64μg/ml)的RCD藥液于體外連續(xù)作用1、3、5、7日，考察藥物對(duì)念珠菌成熟生物被膜的清除效果。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果證實(shí)，RCD對(duì)于生長(zhǎng)24 h的C.albicans生物被膜有抗菌效果，且藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，

9、濃度越高，其抑制被膜生長(zhǎng)的強(qiáng)度就越強(qiáng)。以評(píng)價(jià)被膜中細(xì)胞活力為目的的形態(tài)學(xué)試驗(yàn)亦證明，藥物濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)可降低被膜中細(xì)胞的活力，甚至將被膜完全清除。試驗(yàn)同時(shí)考察了RCD與FLC聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)于體外C.albicans生物被膜的抑制作用。結(jié)果顯示，與FLC單用相比，RCD與FLC聯(lián)用組生物被膜的菌落計(jì)數(shù)顯著降低，提示RCD對(duì)FLC的抗念珠菌生物被膜有增效作用。
　　 課題利用插管相關(guān)性念珠菌生物被膜感染動(dòng)物模型，考察了試驗(yàn)

10、藥物對(duì)于體內(nèi)形成的念珠菌生物被膜的藥效。模型建立后，在生物被膜形成的不同時(shí)段給藥，分別考察RCD對(duì)于生物被膜的預(yù)防和清除作用，應(yīng)用菌落計(jì)數(shù)法和形態(tài)學(xué)觀察法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在被膜形成早期(插管感染4 h)給予RCD，并在插管內(nèi)保留8小時(shí)，感染24小時(shí)后取標(biāo)本觀察，藥物可有效預(yù)防被膜的形成，與對(duì)照組相比，給藥組菌量顯著降低，其抑菌效應(yīng)呈劑量依賴性。將RCD與氟康唑聯(lián)用，可增加后者對(duì)于體內(nèi)被膜形成的預(yù)防效果。在插管感染24 h時(shí)給予不同濃

11、度的RCD，使之在管內(nèi)每日保留8 h，持續(xù)作用5日，藥物對(duì)于生長(zhǎng)24 h的生物被膜同樣有呈劑量依賴性的抑制作用，掃描電鏡的微觀形態(tài)觀察證實(shí)了菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。
　　 為進(jìn)一步研究RCD于體內(nèi)外抑制C.albicans生物被膜的內(nèi)在機(jī)制，設(shè)計(jì)RT-PCR試驗(yàn)，分別取體內(nèi)和體外試驗(yàn)中RCD作用前后的生物被膜標(biāo)本，選擇與菌體黏附和菌絲生長(zhǎng)相關(guān)的基因ALS1，ALS3，ECE1，EFG1，HWP1及上游調(diào)節(jié)基因CDC35進(jìn)行擴(kuò)增，并與不加藥