群體感應(yīng)分子對(duì)白色念珠菌早期生物膜的影響.pdf

1、白色念珠菌(Candida albicans)是人類口腔內(nèi)常見(jiàn)的條件致病真菌，生物膜是口腔白色念珠菌最常見(jiàn)的生存方式，在臨床感染中有重要意義。近年來(lái)許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)與白色念珠菌生物膜形成及其穩(wěn)定的維持密切相關(guān)。farnesol(法呢醇)和tyrosol(對(duì)羥基苯乙醇)是目前已知的白色念珠菌特有的兩種群體感應(yīng)分子，對(duì)前者的研究較為深入，而對(duì)后者的作用研究較少。本研究應(yīng)用倒置顯微鏡和RT-PCR技術(shù)觀察了兩種群體感應(yīng)分子對(duì)白色念珠菌早期

2、生物膜(90min)細(xì)胞形態(tài)以及HTA1和EFG1基因表達(dá)的調(diào)控，同時(shí)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)群體感應(yīng)分子對(duì)白色念珠菌早期生物膜細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了定量分析，以期為深入研究tyrosol和farnesol的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。 第一部分群體感應(yīng)分子對(duì)白色念珠菌早期生物膜細(xì)胞形態(tài)的作用　　 【材料和方法】采用含漱法獲取白色念珠菌臨床株，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0×106/mL的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株標(biāo)準(zhǔn)菌懸

3、液，5％CO2，37℃條件下以50mL培養(yǎng)瓶作為載體構(gòu)建白色念珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生長(zhǎng)過(guò)程中，根據(jù)作用的群體感應(yīng)分子不同設(shè)置三組處理組和一組對(duì)照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM farnesol(farnesol組)；(3)：50μM farnesol+500μM tyrosol(混合處理組)； (4)：無(wú)群體感應(yīng)分子(對(duì)照組)。對(duì)培養(yǎng)90min后形成的白色念珠菌早期生物

4、膜在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)觀察無(wú)群體感應(yīng)分子作用時(shí)生長(zhǎng)48小時(shí)的成熟生物膜。 【結(jié)果】tyrosol組和對(duì)照組早期生物膜內(nèi)均以菌絲相細(xì)胞為主；farnesol組和混合處理組早期生物膜中白色念珠菌細(xì)胞主要表現(xiàn)為孢子相。培養(yǎng)48h后白色念珠菌成熟生物膜內(nèi)包含了菌絲相、孢子相和假菌絲等多種形態(tài)的細(xì)胞，以菌絲相為主，同時(shí)夾雜有細(xì)胞外多聚物基質(zhì)。 【結(jié)論】Tyrosol對(duì)白色念珠菌早期生物膜內(nèi)細(xì)胞的菌絲形成無(wú)明顯促進(jìn)作用

5、，而farnesol則對(duì)早期生物膜內(nèi)細(xì)胞的菌絲形成表現(xiàn)出明顯的抑制作用；當(dāng)環(huán)境中有farnesol存在時(shí)，即使高濃度的tyrosol也無(wú)法改變其對(duì)菌絲形成的抑制作用。 第二部分群體感應(yīng)分子對(duì)早期生物膜內(nèi)白色念珠菌HTA1和EFG1基因表達(dá)的調(diào)控 【材料和方法】將保種的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株復(fù)蘇，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0×106/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，5％CO2，37℃條件下以50 mL培養(yǎng)瓶作為載體構(gòu)建白色念

6、珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生長(zhǎng)過(guò)程中，根據(jù)作用的群體感應(yīng)分子不同設(shè)置三組處理組和一組對(duì)照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM farnesol(farnesol組)；(3)：50μM farnesol+500μM tyrosol(混合處理組)； (4)：無(wú)群體感應(yīng)分子(對(duì)照組)。用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮取生長(zhǎng)90min的早期生物膜，用Trizol試劑盒提取白色念珠菌RNA后進(jìn)行RT-PCR

7、測(cè)試，觀察各組組蛋白編碼基因HTA1和菌絲形成相關(guān)基因EFG1的表達(dá)是否有差異。 【結(jié)果】與對(duì)照組相比，tyrosol組白色念珠菌HTA1的表達(dá)有所增強(qiáng)(P<0.05)，EFG1的表達(dá)并無(wú)明顯改變(P>0.05)；farnesol組HTA1和EFGl的表達(dá)均受明顯抑制(P<0.05)；混合處理組HTA1和EFG1的表達(dá)的亦受到明顯的抑制(P<0.05)。 【結(jié)論】tyrosol能提高白色念珠菌早期生物膜內(nèi)細(xì)胞HTA1的轉(zhuǎn)

8、錄水平，但對(duì)EFG1的表達(dá)無(wú)明顯促進(jìn)作用，farnesol對(duì)白色念珠菌早期生物膜內(nèi)細(xì)胞HTA1及EFG1均有明顯抑制作用；當(dāng)tyrosol和farnesol同時(shí)作用時(shí)，前者無(wú)法改變farnesol對(duì)基因表達(dá)的下調(diào)作用，后者的作用更占優(yōu)勢(shì)。 第三部分群體感應(yīng)分子對(duì)白色念珠菌早期生物膜細(xì)胞增殖的作用 【材料和方法】將保種的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株復(fù)蘇，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0x106/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，5％C

9、O2，37℃條件下構(gòu)建白色念珠菌早期生物膜模型。MTT實(shí)驗(yàn)采用的生物膜構(gòu)建載體為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，根據(jù)作用的群體感應(yīng)分子不同設(shè)置三組處理組和一組對(duì)照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM famesol(famesol組)；(3)：50μM famesol+500 μM tyrosol(混合處理組)；(4)：無(wú)群體感應(yīng)分子(對(duì)照組).早期生物膜形成后加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板棄去孔內(nèi)液

10、體，加入DMSO，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光度值(OD490)，比較不同群體感應(yīng)分子處理對(duì)白色念珠菌早期生物膜細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的影響。 【結(jié)果】與對(duì)照組相比，tyrosol組白色念珠菌早期生物膜內(nèi)細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，而famesol組和混合處理組生物膜內(nèi)細(xì)胞增殖卻受到明顯抑制(P<0.05)。 【結(jié)論】tyrosol對(duì)白色念珠菌早期生物膜細(xì)胞增殖無(wú)顯著促進(jìn)作用；famesol能夠抑制白色念珠