白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變與氟康唑耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、背景：
　　 隨著廣譜抗生素和糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，介入治療和器官移植的普遍開展，艾滋病、腫瘤和糖尿病病人的增加，念珠菌感染呈逐年上升的趨勢。在臨床治療的過程中，由于抗真菌藥物的廣泛和長期應(yīng)用導(dǎo)致了耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，影響臨床治療效果，因此研究真菌耐藥的分子機(jī)制不僅有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)還能更好的指導(dǎo)臨床用藥。
　　 氟康唑是1978年發(fā)現(xiàn)的氟代三唑類藥物，具有抗菌譜廣、半衰期長(27-34h)、生物利用度高

2、、不良反應(yīng)發(fā)生率低、可通過血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，是目前治療念珠菌感染的首選藥物。但長期反復(fù)的應(yīng)用導(dǎo)致了氟康唑耐藥菌株的出現(xiàn)。
　　 白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。從基因水平研究白念珠菌對氟康唑耐藥機(jī)制的報道主要集中于歐美國家，國內(nèi)研究相對較少。目前研究認(rèn)為，白念珠菌耐藥主要有以下三種機(jī)制：(1)藥物靶酶基因ERG11突變或過度表達(dá)；(2)外排泵基因(CDR1、CDR2、MDR1)的過度表達(dá)；(3)生物膜的形成。
　　 麥角

3、固醇是真菌細(xì)胞膜的特有脂質(zhì)。它維持著細(xì)胞膜的完整性和正常功能。細(xì)胞色素P450依賴的14α－去甲基化酶(Erg11 p)是麥角固醇合成途徑中的限速酶，其編碼基因?yàn)镋RG11基因。氟康唑可以與14α-去甲基化酶結(jié)合從而影響該酶的活性，進(jìn)而阻止麥角固醇的合成。ERG11基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致編碼蛋白的改變從而影響Erg11 p的空間構(gòu)象，引起Erg11 p與藥物的親和力降低或底物/藥物進(jìn)出通道發(fā)生改變。迄今報道的ERG11基因錯義突變已逾160

4、種。
　　 在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)14株氟康唑耐藥的白念珠菌僅含有G487T和T916C突變，且并不伴隨其它突變。最近有文章報道在人工誘導(dǎo)的氟康唑耐藥株中也同樣發(fā)現(xiàn)這兩個突變。到目前為止，G487T和T916C兩突變僅在氟康唑耐藥菌株中出現(xiàn)，但其與氟康唑耐藥的關(guān)系并未得到實(shí)驗(yàn)室證實(shí)。
　　 目的：
　　 運(yùn)用表達(dá)質(zhì)粒過表達(dá)和基因敲除的方法，研究ERG11基因6487T和T916C突變與白念珠菌氟康唑耐藥的關(guān)系。<

5、br>　　 方法：
　　 1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測定和ERG11基因突變檢測
　　 應(yīng)用微量稀釋法對前期分離的氟康唑耐藥株GZ16和標(biāo)準(zhǔn)株SC5314(由Richard Calderone教授惠贈)進(jìn)行氟康唑MIC的測定。分別提取兩株菌的基因組DNA，參照白念珠菌ERG11標(biāo)準(zhǔn)序列(GeneBank X13296)設(shè)計引物，擴(kuò)增GZ16和SC5314的ERG11基因并測序。
　　 2.E

6、RG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 以GZ16的ERG11基因?yàn)槟０?，通過重疊PCR得到無突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段，膠回收純化后分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO。以GZ16、pFA-CaURA3、pFA-SAT1為模板，通過PCR得到ERG11基因下游片段、URA3選擇

7、標(biāo)記片段、SAT1選擇標(biāo)記片段，經(jīng)膠回收純化分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-DOWN、pGM-URA3、pGM-SAT1。
　　 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別雙酶切質(zhì)粒pGM-916C、pGM-DOWN、pGM-URA3、和PCDNA3.1，得到具有粘性末端的4片段：含T916C突變的ERG11片段、URA3選擇標(biāo)記片段、ERG11基因下游片段和pCDNA3.1片段。4片段經(jīng)連接酶連接后得到以URA3為選擇標(biāo)記含突變片段的

8、質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3，該質(zhì)粒骨架為pcDNA3.1。重復(fù)以上步驟得到以URA3為選擇標(biāo)記的無突變的、含G487T突變、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-TWO-URA3，以及以SAT1為選擇標(biāo)記的無突變的、含G487T突變的、含T916C突變的、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-SAT1、

9、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1-TWO-SAT1。
　　 以pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO為模板，PCR擴(kuò)增，得到無突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段，片段雙酶切后分別與釀酒酵母表達(dá)載體YEP351G連接得到釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G-487T、YEP35

10、1G-916C和YEP351G-TWO。
　　 3.含不同突變的YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測定
　　 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法，分別用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G－916C、YEP351G－487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并測定陽性克隆對氟康唑的MIC值。
　　 4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測定

11、>　　 限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3得到相應(yīng)的長度為3.7kb的敲除片段，醋酸鋰轉(zhuǎn)化白念珠菌CAI4，尿嘧啶缺陷的培養(yǎng)基選擇陽性克隆，并測定陽性克隆對氟康唑的MIC值。
　　 結(jié)果：
　　 1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測定和ERG11基因突變檢測
　　 白念株菌GZ16為我們以前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的氟康唑耐藥菌株，經(jīng)5次傳代后其氟康唑MIC值仍為64μ

12、g/ml。標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的氟康唑MIC值為2μ g/ml，為氟康唑敏感菌株。GZ16僅含有G487T和T916C突變。SC5314含有T462A、T495A、A504G、A530C、C558T、C805T、A1167G、A1587G突變，其中氨基酸錯義突變?yōu)镕105L(T462A)、D116E(T495A)、K128T(A530C)。
　　 2.ERG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 構(gòu)建

13、了以URA3為選擇標(biāo)記的ERG11基因突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-916C-URA、pcDNA3.1-TWO-URA3，以及以SAT1為選擇標(biāo)記的 ERG11基因突變片段質(zhì)粒 pcDNA3.1-N-SAT1、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1－TWO－SAT1；并成功構(gòu)建了釀酒酵母突變表達(dá)載體YEP351G-

14、N、YEP351G－487T、YEP351G－916C和YEP351G-TWO。
　　 3.YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測定
　　 用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G－916C、YEP351G－487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1后，用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基成功篩選出相應(yīng)的陽性克隆株INVSc1+N、INVSc1+487T INVSc1+916C、INVSc1+TWO，其對氟

15、康唑的MIC值分別為32μ g/ml、32μ g/ml、128μ g/ml、128μ g/ml，釀酒酵母INVSc1對氟康唑的MIC值為8μ g/ml。
　　 4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測定
　　 在T916C突變菌株的構(gòu)建中用尿苷缺陷的培養(yǎng)基成功得到5株陽性克隆株(T1-T5)，其中有3株存在T916C突變(T1、T3、T5)，而兩株雖然發(fā)生了同源重組但無T916C突變(T2、T4)。CIA-4

16、、T1、T2、T3、T4、T5對氟康唑的MIC值分別為2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了含白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的突變片段質(zhì)粒和能表達(dá)白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的釀酒酵母突變表達(dá)載體。
　　 2.首次證實(shí)了白念珠菌ERG11基因T916C突變與氟康唑耐藥有關(guān)。