耐氟康唑白念珠菌ERG11基因突變篩查及鑒定芯片的研制.pdf

1、隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用和介入療法、器官移植等的深入開展，念珠菌感染呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，而抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用則加速了菌株的耐藥進(jìn)程。從分子水平研究念珠菌對抗真菌藥尤其是唑類藥物的耐藥機(jī)制，解決念珠菌感染的快速診斷和有效治療問題，是目前的熱點。 唑類藥物的問世為治療念珠菌感染拓展了全新的空間，但在其藥物選擇壓力的作用下，念珠菌臨床分離株中耐藥株的比例明顯增加。念珠菌耐藥問題逐漸引起人們的重視，如何有效治療耐菌株的感染

2、正在漸漸成為一個新的醫(yī)學(xué)難題，菌種鑒定和藥敏試驗結(jié)果成為影響臨床治療和判斷預(yù)后的重要因素。 白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。從基因水平研究白念珠菌對唑類藥物的耐藥機(jī)制，國外的報道主要集中于歐美國家，國內(nèi)研究則較少。目前認(rèn)為，白念珠菌對唑類藥物耐藥存在多種機(jī)制，主要包括： (1)藥物靶酶基因ERG11突變或過度表達(dá)。(2)編碼多藥流出通道的基因(CDR1、CDR2、MDR1、FLU1)過度表達(dá)。(3)生物被膜的形成。(4)細(xì)胞內(nèi)

3、液泡封閉藥物分子。 ERG11是羊毛甾醇14α-去甲基化酶的編碼基因，14α-去甲基化酶是念珠菌細(xì)胞膜麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，對維持細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。唑類抗真菌藥物分子可與14α-去甲基化酶分子結(jié)合，阻斷羊毛固醇去甲基化過程，影響麥角固醇合成。ERG11的突變可以改變14α-去甲基化酶的氨基酸序列，當(dāng)這種改變足以影響酶分子的空間構(gòu)型時，酶分子與藥物分子間的親和力可能被削弱，導(dǎo)致菌株耐藥。理論上，菌株.ERG

4、11基因的過度表達(dá)可以使14α-去甲基化酶表達(dá)增加，在有限濃度的藥物作用下，仍然維持良好的麥角固醇生物合成通路，也可以造成菌株耐藥。但現(xiàn)在多認(rèn)為菌株耐藥性的形成與ERG11的過度表達(dá)無關(guān)，ERG11基因的突變才是這一耐藥機(jī)制的主要方面。迄今報道的ERG11基因錯義已逾70種，可以引起14α-去甲基化酶在61個氨基酸殘基上發(fā)生69種改變。其中，已經(jīng)實驗證實可以導(dǎo)致菌株對氟康唑耐藥的氨基酸置換僅有6種，即Y132H、T315A、S405F、

5、G464S、R467K和I471T。在單株耐藥菌株中，可以是多種耐藥機(jī)制并存，共同參與菌株耐藥性的形成；也可以是僅有一種機(jī)制起作用，例如，單純ERG11基因T541C點突變即可導(dǎo)致菌株耐藥。如果能夠利用分子生物學(xué)手段檢測到可以直接導(dǎo)致菌株耐藥的基因突變，即可以在不必進(jìn)行藥敏試驗的情況下確定菌株的耐藥表型?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)和成熟，為這一設(shè)想提供了技術(shù)平臺。 基因芯片又被稱為DNA芯片(DNA chip)、DNA陣列(DNA ar

6、ray)、DNA微陣列(DNA microarray)等，該技術(shù)是近年出現(xiàn)的分子生物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸檢測分析技術(shù)，采用原位合成或顯微點樣技術(shù)將大量DN_A探針有序地固化于支持物表面，然后與帶有標(biāo)記的核酸樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，獲得樣品的基因序列、基因表達(dá)等遺傳信息。該技術(shù)具有高度并行性、多樣性、微型化和快速自動化等特點，成為后基因組時代最重要的基因功能分析技術(shù)之一。基因芯片技術(shù)已經(jīng)滲透到生物科學(xué)領(lǐng)域的許多方面，有人

7、將其應(yīng)用于念珠菌全基因組多種基因的檢測，并用于比較氟康唑敏感株和耐藥株間的差別，也有人將其用于包括念珠菌在內(nèi)的真菌菌種鑒定，認(rèn)為DNA芯片在菌種鑒定方面具有極高的敏感性和特異性。但在用DNA芯片檢測白念珠菌耐藥菌株方面，國內(nèi)外均未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。 目的:了解念珠菌臨床分離株的菌種分布情況和對氟康唑的敏感性。篩查白念珠菌ERG11基因的錯義突變，探討突變與氟康唑耐藥之間的關(guān)系。制備DNA芯片，鑒定常見的念珠菌種和可導(dǎo)致菌株對氟康唑

8、耐藥的ERG11突變，對DNA芯片技術(shù)應(yīng)用于念珠菌菌種鑒定和藥敏鑒定進(jìn)行初步探索。 方法：收集臨床標(biāo)本，培養(yǎng)并分離念珠菌株，轉(zhuǎn)種于改良SDA.斜面上4℃保存。利用CHROMagar顯色培養(yǎng)基作為初篩手段，鑒定白念珠菌(含都柏林念珠菌)、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；輔以血清芽管生成試驗、蔗糖同化試驗、玉米土溫80厚壁孢子形成試驗來進(jìn)一步確認(rèn)白念珠菌和都柏林念珠菌；輔以四氮唑紅(TZC)還原試驗來進(jìn)一步確認(rèn)熱帶念珠菌；近平滑

9、念珠菌及其它念珠菌以VITEK2自動鑒定系統(tǒng)鑒定；PCR擴(kuò)增白念珠菌(含都柏林念珠菌)25S rDNA轉(zhuǎn)座內(nèi)含子保守序列，區(qū)分白念珠菌和含都柏林念珠菌并進(jìn)行白念珠菌種內(nèi)分型。聯(lián)合應(yīng)用微量稀釋法和紙片擴(kuò)散法，體外測定氟康唑?qū)υ囼灳甑腗IC，確定敏感株(S)、劑量依賴敏感株(S-DD)和耐藥株(R)。微量稀釋法按照美國臨床試驗標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)制定的M27-A2方案實施，判讀結(jié)果時，需對照紙片擴(kuò)散法的結(jié)果，如結(jié)果相抵觸，則重復(fù)試驗再判讀

10、，最終以微量稀釋法結(jié)果為準(zhǔn)。 參考白念珠菌ERG11標(biāo)準(zhǔn)序列(GeneBank X13296)設(shè)計3對引物，用Pfu高保真DNA多聚酶分段擴(kuò)增全部白念珠菌臨床耐藥株、2株標(biāo)準(zhǔn)耐藥株、4株標(biāo)準(zhǔn)敏感株、部分臨床敏感株的ERG11基因，以其中ERG11序列已明確的2株標(biāo)準(zhǔn)耐藥株作為質(zhì)控。用凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測突變。 根據(jù)白念珠菌ERG11基因T541C、A1090G、C1361T、

11、G1537A、G1547A、T1559C等6種突變序列，每種突變設(shè)計至少2條等位基因特異性探針(PM)和1條錯配探針(MM)；根據(jù)白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌等6種真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2保守序列，分別設(shè)計1條種特異性探針。用OmniGridTM100點樣儀制備DNA芯片，每個探針重復(fù)三次，形成三個陣列。用雙重PCR方法擴(kuò)增經(jīng)ERG11測序的白念珠菌和熱帶念珠菌C2a、光滑念珠菌Y10a、都

12、柏林念珠菌C8a、克柔念珠菌ATCC6258、近平滑念珠菌ATCC22019等5株標(biāo)準(zhǔn)株的ERG11和ITS2種特異性序列。用醋酸鈉/乙醇法純化雙重PCR產(chǎn)物，用DNase I進(jìn)行酶切片段化，使酶切產(chǎn)物的片段長度在100 bp左右。針對T541C、A1090G、C1361T、G1537A、G1547A、T1559C等6種ERG11突變序列和白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌等6種常見條件致病性念珠菌

13、的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(IST2)種特異性序列，人工合成12條50 bp互補(bǔ)寡核苷酸鏈。用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TDT)對片段化的雙重PCR產(chǎn)物和50 bp寡核苷酸鏈進(jìn)行Cy3熒光素標(biāo)記后，進(jìn)行芯片雜交。雜交后的芯片用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描，利用GenePix Pro提取每條探針的熒光信號強(qiáng)度值，做出菌種鑒定和突變檢測。 結(jié)論： (1)白念珠菌仍是最主要的致病性念珠菌，白念珠菌的分離比例和念珠菌對氟康