黃芩苷對(duì)支氣管哮喘的藥效學(xué)及其對(duì)苦味受體作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究中藥單體成分黃芩苷對(duì)治療支氣管哮喘的藥效學(xué)考察，并初步探討其對(duì)苦味受體的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、霧化吸入法測定黃芩苷對(duì)豚鼠引喘潛伏期的影響。
　　 2、離體氣管片法測定不同濃度黃芩苷對(duì)豚鼠氣管舒張作用。
　　 3、耳腫脹法測定黃芩苷的抗炎作用。
　　 4、MTT法檢測黃芩苷對(duì)HBSMC細(xì)胞活性影響。
　　 5、血常規(guī)測定不同濃度(5、10、25mg/ml)黃芩苷對(duì)哮喘

2、模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％的影響。
　　 6、HPLC測定霧化吸入10mg/ml黃芩苷1h后，不同時(shí)間段(0.Sh、1h、2h、4h、8h、24h、48h)小鼠肺臟和血液中黃芩苷濃度。
　　 7、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HBSMC細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，瓊脂糖凝膠電泳法驗(yàn)證hTAS2R14在HBSMC細(xì)胞上的表達(dá)情況。
　　 8、pcDNA3

3、.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光素酶法檢測不同濃度(10-9～10-4mol/L)黃芩苷對(duì)hTAS2R14表達(dá)影響。9激光共聚焦鈣離子成像法檢測黃芩苷(1mmol/ml)對(duì)已轉(zhuǎn)染hTAS2R14基因的HEK293T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、黃芩苷對(duì)豚鼠引喘潛伏期的影響
　　 霧化吸入法測定引喘潛伏期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給藥后各組引喘潛伏期均有不同程度延長，但黃芩苷組

4、與陽性藥組較正常對(duì)照組延長時(shí)間更長，同時(shí)，黃芩苷組（5mg/ml黃芩苷水溶液）的引喘潛伏期時(shí)間顯著高于陽性藥組（5mg/ml沙丁胺醇溶液）。
　　 2、不同濃度黃芩苷對(duì)豚鼠氣管舒張作用
　　 氣管片張力實(shí)驗(yàn)測定黃芩苷對(duì)豚鼠氣管舒張作用發(fā)現(xiàn)，黃芩苷高劑量組對(duì)乙酰膽堿刺激收縮的豚鼠離體氣管片舒張率略低于多索茶堿組（為43.07％)，且舒張趨勢較多索茶堿組平緩，但舒張作用持續(xù)時(shí)間長于多索茶堿。黃芩苷低劑量組對(duì)正常氣管無舒張作用

5、，但也可在一定程度上舒張被乙酰膽堿刺激收縮的豚鼠離體氣管片，最大舒張率為24.63％，且具有劑量依賴性。
　　 3、黃芩苷的抗炎作用
　　 小鼠耳腫脹法測定黃芩苷對(duì)小鼠的抗炎作用，通過測定耳片厚度發(fā)現(xiàn)黃芩苷(10mg/ml)能夠有效對(duì)抗二甲苯所致的小鼠耳腫脹，給藥后不同時(shí)間段(1h、2h、6h)黃芩苷組小鼠耳片厚度均低于模型組，其作用效果與陽性藥（皮炎平軟膏）組相比，1h、6h黃芩苷組抗炎作用效果略低于陽性藥組，2h黃芩

6、苷組抗炎作用與陽性藥組基本持平。測定給藥后各組小鼠臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷組耳片指數(shù)差介于陽性藥組與模型組之間;脾指數(shù)與陽性藥組持平，均低于模型組;胸腺指數(shù)三組間無顯著性差異。
　　 4、黃芩苷對(duì)HBSMC細(xì)胞活性影響
　　 MTT法測定發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)HBSMC細(xì)胞活性無抑制作用(IC50＞100μM)。
　　 5、黃芩苷對(duì)哮喘模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％的影響
　　 通過檢測不同劑量

7、黃芩苷（5、10、25 mg/ml）干預(yù)哮喘模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠各項(xiàng)血液指標(biāo)均與正常組大鼠有顯著性差異(p＜0.01)，同時(shí)黃芩苷中劑量組(10mg/ml)與模型組各項(xiàng)大鼠血液指標(biāo)亦存在顯著性差異(p＜0.01)，提示哮喘大鼠模型建立成功，且中劑量黃芩苷對(duì)哮喘模型大鼠有一定的保護(hù)作用。
　　 6、霧化吸入黃芩苷后，不同時(shí)間段小鼠肺臟和血液中藥物濃度
　　 在本色譜條件下黃芩

8、素與內(nèi)標(biāo)化合物分離良好，黃芩苷在0.5～95mg/L內(nèi)呈線性關(guān)系;黃芩苷的最低檢測濃度為0.05mg/L。測定黃芩苷(10mg/ml)霧化吸入1h后，48小時(shí)內(nèi)小鼠肺臟中的代謝曲線，我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷濃度在給藥后0.5h首次出現(xiàn)最大值(46.57±0.52mg/L)，之后濃度隨時(shí)間逐漸降低，2h開始逐漸升高，至4h黃芩苷濃度達(dá)到第二次高峰（21.67±0.35mg/L），但至48h代謝完全，殘留量趨于零。同時(shí)測定黃芩苷在小鼠血液中代謝曲線，

9、我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷在小鼠體內(nèi)血藥濃度在2h達(dá)到峰值(4.87±0.54 mg/L)，之后稍有下降，至4h后逐漸升高，8h后血藥濃度趨于平穩(wěn)(3.58～3.54mg/L)，至48h略有升高（4.76±0.23mg/L）。
　　 7、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HBSMC細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率，驗(yàn)證hTAS2R14在HBSMC細(xì)胞上的表達(dá)情況
　　 熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染HBSMC

10、細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率大于60％,提取細(xì)胞中質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)檢測發(fā)現(xiàn)所提質(zhì)粒純度良好，濃度適中，PCR反應(yīng)結(jié)果驗(yàn)證所合成的含目的基因的質(zhì)粒表達(dá)良好，且轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染條件可用;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)未被轉(zhuǎn)染的HBSMC細(xì)胞中亦含有hTAS2R14基因。
　　 8、pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，檢測黃芩苷對(duì)hTAS2R14表達(dá)影響
　　 測定已轉(zhuǎn)染目的基因的HEK293T細(xì)胞在不同濃度(10

11、-9～10-4)黃芩苷刺激后熒光強(qiáng)度變化，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度在10-6～10-4濃度范圍內(nèi)明顯增大，且熒光強(qiáng)度與藥物濃度存在一定的劑量依賴性，提示黃芩苷可能作用于目的基因hTAS2R14，并促進(jìn)其表達(dá)。
　　 9、黃芩苷對(duì)已轉(zhuǎn)染hTAS2R14基因的HEK293T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響
　　 黃芩苷（1mmol/L）對(duì)已轉(zhuǎn)染目的基因的HEK293T細(xì)胞刺激后，應(yīng)用激光共聚焦鈣離子成像法動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，我們發(fā)現(xiàn)在給予

12、黃芩苷刺激后，HBSMC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在0～5s內(nèi)迅速增高，在5～40s緩慢降低至初始濃度。
　　 結(jié)論:黃芩苷在治療支氣管哮喘的過程中，具有良好的體內(nèi)外抗炎效果和氣管松弛作用，在作用過程中對(duì)支氣管平滑肌無損傷作用;霧化吸入后在肺臟中代謝迅速，殘留量低;單次給藥后在較長時(shí)間內(nèi)，能夠維持穩(wěn)定的血藥濃度。同時(shí)能夠通過苦味受體這一新的途徑，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道，舒張支氣管平滑肌。
　　 因此，中藥單體成分黃芩苷是一個(gè)具有