雙龍膠囊治療支氣管哮喘的藥效學(xué)研究和免疫學(xué)機(jī)理探討.pdf

1、支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是最常見的以氣道高反應(yīng)性(AHR)為特征的慢性呼吸道疾病，被世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為四大頑癥之一。哮喘的病理學(xué)改變以氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主，肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤為輔的慢性氣道炎癥為基本特征，臨床上以氣道炎癥誘發(fā)的氣道高反應(yīng)性和氣道通氣障礙為主要特征。多數(shù)國家的哮喘防治方案均采用局部療法，應(yīng)用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的抗炎藥物治療為目前比較流行的治療手段，但從流行病學(xué)分析，并未發(fā)現(xiàn)哮喘患病率和死亡率降低，這提示

2、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未能提出根治哮喘方案，而且眾所周知的長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用，使其在廣泛應(yīng)用上受限。中醫(yī)藥學(xué)在長期的醫(yī)療實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)前的治療方法很多來源于中醫(yī)藥。 長期以來受中醫(yī)只適合于慢性病觀點(diǎn)的束縛，目前中醫(yī)藥在支氣管哮喘中的臨床應(yīng)用多局限于哮喘的緩解期，本課題研究的對象是基于多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)研制的中藥新制劑“雙龍膠囊”，旨在對其療效的確認(rèn)和治療作用的免疫學(xué)機(jī)制探討，力求尋找可以用于哮喘發(fā)作期的中藥制劑。

3、1.文獻(xiàn)綜述查閱整理了近10年來國內(nèi)外支氣管哮喘的相關(guān)研究文獻(xiàn)資料，對目前西醫(yī)、中醫(yī)對于哮喘的致病因素、臨床診斷、發(fā)病機(jī)理、治療用藥研究概況進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)和綜述，掌握了相關(guān)領(lǐng)域科研前沿動(dòng)態(tài)，并提出了中醫(yī)藥治療哮喘的優(yōu)勢、不足及努力方向。 2.實(shí)驗(yàn)研究2.1處方論證在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，在多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)藥研究成果，確定了處方組成和疏風(fēng)解表，清肺化痰，降氣平喘的功能，該方用于哮病風(fēng)哮證，癥見時(shí)發(fā)時(shí)止，發(fā)時(shí)喉中哮

4、鳴有聲，反復(fù)發(fā)作，止時(shí)又如常人，發(fā)作前鼻癢，噴嚏，咳嗽，痰粘。支氣管哮喘發(fā)作期見上述證候者。 2.2雙龍膠囊治療哮喘的藥效學(xué)研究2.2.1雙龍膠囊對肺功能的影響實(shí)驗(yàn)中分別選用大鼠和豚鼠兩種動(dòng)物，用卵清蛋白注射致敏動(dòng)物，造成發(fā)作期哮喘模型，建模完成后，實(shí)驗(yàn)組以三個(gè)不同劑量胃飼雙龍膠囊(6.30g·kg-1·d-1，3.15g·kg-1·d-1，1.58個(gè)·kg-1·d-1，分別相當(dāng)于臨床人用量14倍、7倍、3.5倍)，并設(shè)陽性對照

5、組胃飼地塞米松(1.4mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于人臨床用量7倍)，正常對照組給予生理鹽水，再以卵蛋白作為抗原攻擊激發(fā)氣道高反應(yīng)性，測定大鼠肺功能的變化，觀察誘發(fā)豚鼠哮喘的潛伏期。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在大鼠肺功能測定實(shí)驗(yàn)中，正常對照組最大呼出量(PEF)，0.2秒呼出容積(Fev0.2)，第0.2秒用力呼出容積占用力肺活量百分比(Fev0.2/FVC)分別為6.87、46.38和81.45，與正常對照組相比，哮喘模型組此三指標(biāo)顯著降低，可分別

6、降至5.88、39.95和63.26，地塞米松組與中藥各劑量組均可明顯升高PEF、Fev0.2、Fev0.2/FVC比值(P＜0.05)。在豚鼠行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中，豚鼠以卵蛋白激發(fā)引喘第1天，哮喘模型組引喘期為114.2s，正常對照組在5min內(nèi)沒有出現(xiàn)喘息癥狀，中藥6.30g·kg-1·d-1，3.15g·kg-1·d-1劑量組可分別將引喘潛伏期延長至197.0s和206.1s(P＜0.05)，表明中藥對急性發(fā)作期哮喘癥狀均有對抗作用。

7、統(tǒng)計(jì)激發(fā)引喘6天內(nèi)動(dòng)物的死亡率可見哮喘模型組因哮喘發(fā)作窒息而死的動(dòng)物死亡率達(dá)20％，而地塞米松及中藥6.30g·kg-1·d-1，3.15g·kg-1·d-1劑量組動(dòng)物死亡率均僅為6.67％。采用大鼠和豚鼠兩個(gè)哮喘模型進(jìn)行藥效學(xué)研究，兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明雙龍膠囊可明顯抑制哮喘動(dòng)物氣道高反應(yīng)，改善呼吸功能。 2.2.2雙龍膠囊對哮喘動(dòng)物炎性細(xì)胞滲出的影響建立大鼠、豚鼠兩種哮喘動(dòng)物模型，分別胃飼中藥雙龍膠囊并以地塞米松為陽性對照藥，

8、實(shí)驗(yàn)中兩種模型選用相同指標(biāo)進(jìn)行觀察。以抗原末次激發(fā)引起哮喘發(fā)作后，處死動(dòng)物，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，并作肺組織病理切片觀察，觀察炎性細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)在肺組織和肺泡灌洗液中的滲出情況。數(shù)據(jù)顯示，兩種哮喘動(dòng)物BALF液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，在大鼠哮喘模型中，BALF中的EOS可升高至26.56％，雙龍膠囊6.30g·kg-1·d-1，3.15g·kg-1·d-1劑量組可將EOS降為19.39％和1

9、8.75％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在豚鼠哮喘模型中，哮喘動(dòng)物BALF中EOS為23.4％，中藥雙龍膠囊6.30g·kg-1·d-1，3.15g·kg-1·d-1劑量組可分別將EOS降至13.3％和16.6％，并具有顯著性差異(P＜0.05)。肺組織病理切片觀察可見哮喘動(dòng)物肺組織炎性細(xì)胞滲出增多，氣道上皮脫落明顯，給藥雙龍膠囊和地塞米松后均可改變炎性癥狀。結(jié)果表明兩種動(dòng)物哮喘模型均具肺部炎癥特征，雙龍膠囊可抑制炎性細(xì)胞滲出，減輕

10、氣道炎癥。 2.3雙龍膠囊治療哮喘的免疫學(xué)機(jī)理探討2.3.1雙龍膠囊對哮喘大鼠肺組織炎性介質(zhì)白三烯的影響建立大鼠哮喘模型，給藥治療14天，末次激發(fā)后取材，采用反向高效液相法(RP-HPLC)測定各組大鼠肺組織勻漿中LTB4、LTC4、LTD4含量，并進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)顯示，正常對照組大鼠肺組織中LTB4、LTC4、LTD4含量分別1.20ng·g-1、2.53ng·g-1和1.72ng·g-1，模型組大鼠三個(gè)指標(biāo)均明顯升高，分別達(dá)到

11、2.73ng·g-1、5.53ng·g-1和5.34ng·g-1(P＜0.05)，地塞米松和雙龍膠囊6.30g/kgkg-1·d-1和3.15g/kgkg-1·d-1劑量組均可顯著抑制LTB4、LTC4、LTD4含量增高，結(jié)果表明雙龍膠囊有地塞米松樣抑制大鼠肺部白三烯滲出的作用。 2.3.2哮喘大鼠血清總IgE及ECP水平測定建立大鼠哮喘模型，給藥治療14天，末次抗原激發(fā)后取血清，用ELISA法測定大鼠血清中總IgE及ECP，結(jié)

12、果顯示正常對照組血清總IgE和ECP水平分別為3.26ng·ml-1和4.5lng·ml-1，與之相比哮喘模型組二者均顯著升高，分別達(dá)到5.06ng·ml-1和5.23ng·ml-1(P＜0.05)，用中藥進(jìn)行治療后，中藥各劑量組的總IgE均呈明顯下降趨勢，中藥低、中、高劑量組IgE分別降至4.61ng·ml-1、4.60ng·m1-1和3.84ng·ml-1(P＜0.05)；以3.15g·kg-1·d-1(中藥中劑量組)胃飼中藥雙龍膠

13、囊后可使血清中ECP水平顯著下降至3.94ng·ml-1(P＜0.05)，表明雙龍膠囊可以通過降低血清總IgE水平，抑制Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，通過減少ECP的生成，抑制氣道炎癥。 2.3.3哮喘大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群測定建立大鼠哮喘模型，胃飼中藥及地塞米松進(jìn)行4天的治療，末次抗原激發(fā)引喘后取材，用流式細(xì)胞儀測定脾臟CD4+及CD8+淋巴細(xì)胞陽性百分率。結(jié)果顯示正常對照組大鼠CD4+/CD8+比值為2.55，哮喘大鼠比值為1.13，表明哮

14、喘大鼠該比值顯著性降低(P＜0.05)，機(jī)體處于免疫功能紊亂狀態(tài)，胃飼中藥雙龍膠囊各劑量組CD4+/CD8+比例均可升高分別可達(dá)到1.4，1.38，1.55，提示該藥可以通過調(diào)節(jié)CD4+/CD8+，使免疫功能紊亂向正常狀態(tài)恢復(fù)，從而達(dá)到治療哮喘的目的。 2.3.4哮喘大鼠CD4+細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的研究建立大鼠哮喘模型，給藥治療14天，末次抗原激發(fā)引喘后取血，以ELISA法測定哮喘大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10

15、及IFN-γ含量。各組數(shù)據(jù)不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，只具變化趨勢，這可能與樣本量過少，或與取材時(shí)間處于哮喘發(fā)作時(shí)相變化交替點(diǎn)有關(guān)，或者其他原因?qū)е陆Y(jié)果無顯著性差異，有待于更多的研究。 80年代以來認(rèn)為Th2細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)為哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，Th1細(xì)胞可以抑制Th2細(xì)胞的表達(dá)；近來有學(xué)者認(rèn)為Th1不一定抑制Th2細(xì)胞，可被看作炎性細(xì)胞參與哮喘發(fā)病過程，提出Treg細(xì)胞可能參與哮喘發(fā)病調(diào)節(jié)的新觀點(diǎn)。對于這兩種觀點(diǎn)的研究分析還需對細(xì)胞因子進(jìn)行

16、更多的研究。 3研究結(jié)論本研究確定了雙龍膠囊處方，通過建立兩種不同動(dòng)物的哮喘模型，并以相同的指標(biāo)進(jìn)行藥效學(xué)觀察，兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明雙龍膠囊具有抗哮喘作用，說明雙龍膠囊用于哮喘發(fā)作期的療效是確切的，課題中以大鼠哮喘模型對雙龍膠囊抗哮喘的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討，認(rèn)為其作用機(jī)制是多環(huán)節(jié)、多方向的，可能與直接擴(kuò)張支氣管、抗炎性滲出、抗變態(tài)反應(yīng)及參與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。 上述研究，采用行為學(xué)、病理組織切片、高效液相、流氏細(xì)胞儀檢測、ELI