RNA干擾下調(diào)宮頸癌Hela細胞Survivin表達及其生物學效應的研究.pdf

1、背景：宮頸癌已成為女性近年來常見惡性腫瘤之一，是由人類乳頭瘤病毒(HPV)引起，在全世界呈發(fā)展中國家的宮頸癌發(fā)病率較高[1]。每年約有二十多萬女性死于此病，我國每年新增病例為13萬以上。預防與治療宮頸癌是醫(yī)學界研究的重要任務。
　　 RNA干擾(RNAi)是近年來研究腫瘤治療的一個新領域，是通過與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾RNA(siRNA)，這些siRNA

2、與同源的靶RNA互補結(jié)合，特異性酶會降解靶RNA而至產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。
　　 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤組織，由于與細胞的生存相關(guān)而稱為生存素。Survivin與細胞凋亡的關(guān)系是通過外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑進行[2]。通過這些途徑能將細胞色素C從線粒體釋放，這是細胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放出的的細胞色素C在dATP存在下能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，使其形成多聚體，并促使

3、caspase-9(半胱氨酸天冬酰胺酶-9)與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，從而進一步激活其它的caspase如caspase-3等，誘導細胞凋亡。Survivin的作用機制主要是通過抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性；或者通過P21間接抑制Caspase[3]。
　　 目的：本研究采用RNA干擾技術(shù)，針對人survivin基因mRNA序列構(gòu)建1個siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細胞，觀察轉(zhuǎn)

4、染后細胞生長形態(tài)變化及其對細胞survivin蛋白表達、survlvmmRNA表達、細胞凋亡及細胞內(nèi)caspase-3酶活性的變化來分析該過程導致的細胞生物學特征的變化。從而為臨床腫瘤的治療提供重要的實驗基礎。
　　 方法：合成survivin基因的有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列，克隆到RNA干擾表達載體pcdna6.2質(zhì)粒上，構(gòu)建pcdna6.2-siRNA(+)和pcdna6.2-siRNA(-)重組質(zhì)粒，同時設空白對照。脂質(zhì)體介

5、導轉(zhuǎn)染Hela細胞后，提取總RNA及蛋白質(zhì)。應用實時熒光定量PCR檢測survivinmRNA，并應用Westernblot技術(shù)檢測蛋白質(zhì)表達水平的變化。采用細胞生長曲線和MTT法檢測Hela細胞增殖能力的改變；采用流式細胞術(shù)實驗觀察survivin下調(diào)后對Hela細胞凋亡生物學行為的影響，最后通過Braford法測定Caspase3蛋白濃度的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建針對Survivin基因的RNA干擾真

6、核表達載體，轉(zhuǎn)染Hela細胞后影響細胞的正常生長并且能夠抑制SurvivinmRNA及蛋白質(zhì)的正常表達。pcDNA6.2-GW/EmGFP-siR(+)組對SurvivinmRNA的相對表達量在48h干擾效果最佳。
　　 2.實時熒光定量PCR、Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcdna6.2-siRNA(+)質(zhì)粒后，Hela細胞中SurvivinmRNA和蛋白表達水平顯著下調(diào)。
　　 3.細胞增殖能力測試結(jié)果表明轉(zhuǎn)染

7、Survivin干擾質(zhì)粒后Hela細胞增殖能力受到明顯抑制。
　　 4.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示實驗組細胞凋亡率約為11.44％，而陰性對照組細胞凋亡率約為4.05％。Caspase3蛋白濃度檢測顯示Survivin基因沉默可升高其活性。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了針對Survivin基因的RNA干擾質(zhì)粒，并證實其在宮頸癌Hela細胞中可下調(diào)SurvivinmRNA及蛋白的表達。Survivin基因沉默可以有效抑制人宮頸癌H