皮秒脈沖電場對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生物學(xué)作用及劑量與效應(yīng)關(guān)系研究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。近年來，宮頸癌三階梯篩查的逐漸普及、人們生活水平的不斷提高和婦女保健意識的不斷增強(qiáng)使得許多宮頸癌患者得以早期發(fā)現(xiàn)和診治，但是傳統(tǒng)的手術(shù)治療往往會使患者的生殖器官遭受嚴(yán)重?fù)p害，影響生育能力及其性功能。嚴(yán)重威脅著患者，尤其是年輕患者的身心健康。雖然現(xiàn)在手術(shù)治療的觀念正向保證療效的同時盡量縮小組織創(chuàng)傷的方向轉(zhuǎn)變，但是保留生育功能的手術(shù)方式有嚴(yán)格的手術(shù)適應(yīng)癥，且術(shù)后妊娠率低，妊娠后發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)的風(fēng)險

2、亦較大。面臨這一新的問題，我們希望找到一種能有效殺死腫瘤細(xì)胞保證療效的同時減少甚至不損害患者的生殖器官以保存患者生育功能及性功能的新的安全的無創(chuàng)治療方法。
　　脈沖電場(Pulsed Electric Fields，PEF)是近年逐步發(fā)展起來的腫瘤治療新方法，不同脈寬的PEF可分別導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生可逆性穿孔(Reversible Electroporation，RE)、不可逆性穿孔(Irreversible ElectricalBre

3、akdown，IREB)和細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)(Intracellular Electromanipulation，IEM)等。然而，微秒(Microsecond，μs)和納秒(Nanosecond，ns)級脈沖電場的引入需要將有創(chuàng)或微創(chuàng)的電極陣列穿刺插入腫瘤組織，這種方式無疑給操作帶來不便、給患者帶來一定的不適，同時可能造成腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移等，因而在一定程度上限制了此方法的應(yīng)用。當(dāng)脈沖電場的場強(qiáng)上升至數(shù)百甚至上千kV/cm、脈寬為皮秒級(

4、即皮秒脈沖電場，Picosecond Pulsed Electric Fields，psPEF）時，其具有豐富的超寬帶頻譜，時間和空間分辨率高，信號失真小。重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室研制的超寬帶沖激脈沖輻射天線（Impulse radiating antenna，IRA）在特定范圍內(nèi)傳輸能量，將脈沖電磁波匯聚在指定區(qū)域，摧毀目標(biāo)，在時間和空間上，輻射能量都很集中。通過匹配IRA，有可能實(shí)現(xiàn)psPEF無創(chuàng)進(jìn)入生物組

5、織并精確靶向聚焦繼而發(fā)揮特殊的生物效應(yīng)。近幾年，本課題組與該實(shí)驗室合作，期望找到一種新的腫瘤物理治療方法。2011年，合作單位對psPEF發(fā)生器進(jìn)行性能改進(jìn)，目前該psPEF發(fā)生器可產(chǎn)生達(dá)600 kV/cm的電場強(qiáng)度，具有穩(wěn)定的放電性能，可以通過IRA進(jìn)行能量聚焦，使無創(chuàng)有效治療腫瘤成為可能。但是現(xiàn)國內(nèi)外對psPEF的相關(guān)研究較少，尚處于基礎(chǔ)階段，本課題組近幾年對psPEF對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用進(jìn)行研究，以期為早期宮頸癌患者找到一種無創(chuàng)

6、、有效、安全、保留生育功能的新方法。
　　本實(shí)驗將以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對象，給予不同參數(shù)的psPEF處理，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞計數(shù)法（flow cytometry，F(xiàn)CM）、透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)檢測細(xì)胞增殖、凋亡及壞死情況，探討psPEF的不同參數(shù)與細(xì)胞增殖、凋亡及壞死的關(guān)系，為后續(xù)的動物實(shí)驗參數(shù)篩選及臨床研究提供依據(jù)。本文從以下兩部分進(jìn)行了闡述。

7、r>　　第一部分皮秒脈沖電場對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及其量效關(guān)系研究。
　　目的:探討psPEF對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及其劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　方法:實(shí)驗分組:根據(jù)psPEF電場強(qiáng)度的不同將HeLa細(xì)胞分為7組:對照組及6個不同電場強(qiáng)度組（100kV/cm組，200kV/cm組，300kV/cm組，400 kV/cm組，500 kV/cm組，600 kV/cm組），各場強(qiáng)組根據(jù)脈沖處理后培養(yǎng)時間的不同進(jìn)一步

8、分為6h、12h、24h、36h、48h5個亞組，各實(shí)驗組psPEF的其它參數(shù)固定為:脈寬800ps，頻率3Hz，脈沖個數(shù)2000個。MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。
　　根據(jù)前面MTT實(shí)驗結(jié)果，后續(xù)試驗中脈沖處理后細(xì)胞培養(yǎng)時間均為12h。在MTT檢測psPEF不同電場強(qiáng)度及脈沖個數(shù)與細(xì)胞增殖抑制的關(guān)系實(shí)驗中分組為:根據(jù)psPEF電場強(qiáng)度的不同將HeLa細(xì)胞分為7組:對照組及6個不同電場強(qiáng)度組（100kV/cm組，200kV/cm組

9、，300kV/cm組，400 kV/cm組，500 kV/cm組，600 kV/cm組），各場強(qiáng)組根據(jù)脈沖個數(shù)的不同分別進(jìn)一步分為1000、2000、30003個亞組，各實(shí)驗組psPEF的其它參數(shù)固定為:脈寬800ps，頻率3Hz。各組于處理后12h以MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。此實(shí)驗得出的結(jié)果中電場強(qiáng)度為200kV/cm、400 kV/cm組、600 kV/cm組時細(xì)胞增殖受抑制情況尤其明顯，因此后續(xù)試驗選擇此三點(diǎn)作為低-中-高電場

10、強(qiáng)度參數(shù)。
　　根據(jù)前面實(shí)驗結(jié)果，在流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布的實(shí)驗中分組為:根據(jù)psPEF電場強(qiáng)度的不同將HeLa細(xì)胞分為4組:對照組及3個不同電場強(qiáng)度組（200kV/cm組，400 kV/cm組，600 kV/cm組），各實(shí)驗組psPEF的其它參數(shù)固定為:脈寬800ps，頻率3Hz，脈沖個數(shù)2000個。作用后12h，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期的分布。
　　結(jié)果:psPEF處理HeLa細(xì)胞后，與對照組相比，各實(shí)驗組細(xì)胞增殖

11、受到明顯的抑制(P＜0.05)，同一實(shí)驗組的細(xì)胞在處理后12h的增殖抑制率高于處理后6h(P＜0.05)，12h、24h、36h、48h各時間點(diǎn)兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在脈沖個數(shù)相同的各場強(qiáng)組中，隨著脈沖場強(qiáng)的升高，細(xì)胞增殖抑制率增加;在各場強(qiáng)相同的脈個數(shù)組中，細(xì)胞增殖抑制率隨著脈沖個數(shù)的增加而增加;在電場強(qiáng)度為600 kV/cm、脈沖個數(shù)為時3000個細(xì)胞抑制率最高。流式細(xì)胞儀檢測皮秒脈沖電場處理后的HeLa細(xì)胞周期

12、分布顯示:實(shí)驗組中處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)較對照組多;在各實(shí)驗組中，隨著場強(qiáng)的升高，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。
　　結(jié)論:一定劑量(電場強(qiáng)度100kV/cm～600kV/cm;脈沖個數(shù)1000～3000)的皮秒脈沖電場能抑制HeLa細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。psPEF對細(xì)胞增殖抑制作用在處理后12h達(dá)最大值，該效應(yīng)與場強(qiáng)、脈沖個數(shù)成正相關(guān)，在psPEF的場強(qiáng)為600 kV/cm、脈沖個數(shù)為3000個時，細(xì)胞抑制率最

13、高。
　　第二部分皮秒脈沖電場對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和壞死的影響及其量效關(guān)系研究。
　　目的:探討不同參數(shù)的psPEF對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和壞死的影響及其劑量與效應(yīng)的關(guān)系。
　　方法:根據(jù)第一部分實(shí)驗結(jié)果，分組如下:分組方案一為對照組及3個不同電場強(qiáng)度組（200kV/cm組，400 kV/cm組，600 kV/cm組），各實(shí)驗組psPEF的其它參數(shù)固定為:脈寬800ps，頻率3Hz，脈沖個數(shù)2000個。于作用

14、后12h以透射電子顯微鏡觀察對照組和各實(shí)驗組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡及壞死情況;分組方案二為對照組及3個不同脈沖個數(shù)組（1000組，2000組，3000組），各實(shí)驗組psPEF的其它參數(shù)固定為:脈寬800ps，頻率3Hz，電場強(qiáng)度400kV/cm。于作用后12h以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡及壞死情況。
　　結(jié)果:psPEF作用于HeLa細(xì)胞后，透射電子顯微鏡下觀察到各實(shí)驗組細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)以及細(xì)胞器腫脹;流式

15、細(xì)胞儀檢測到實(shí)驗組細(xì)胞的凋亡率較對照組明顯增加，實(shí)驗組中400 kV/cm組高于200kV/cm組(P＜0.05)，600 kV/cm組高于400 kV/cm(P＜0.05);2000組高于1000組(P＜0.05)，3000組高于2000組(P＜0.05)，而相鄰兩組間細(xì)胞晚期凋亡及壞死率比較差異不明顯(P＞0.05)。
　　結(jié)論:一定劑量(電場強(qiáng)度100kV/cm～600kV/cm;脈沖個數(shù)1000～3000)的皮秒脈沖電場可