GSTπ基因在宮頸癌中生物學作用的研究.pdf

1、目的：研究外源性Gstπ基因的高表達對宮頸癌細胞生長、轉移、浸潤和輻射敏感性的影響，初步探討Gstπ基因的生物學功能及作用機制。 方法：(1)根據GeneBank中GSTπ的基因序列，自行設計擴增Gstπ基因全長cDNA的引物，將人類全長GSTπ cDNA定向地克隆到真核細胞表達載體pcDNA3中，并采用限制性內切酶酶切分析和DNA序列分析鑒定建立好的pcDNA3.0-GSTπ重組質粒；(2)采用陽離子脂質體介導的質粒轉染法，完

2、成pcDNA3/GSTπ載體和pcDNA3“空”載體(作為陰性對照)轉染，在含有G418的篩選培養(yǎng)基中進一步篩選陽性克隆。采用RT-PCR和Western Blot檢測克隆細胞中GSTπ mRNA和蛋白表達水平；(3)采用細胞計數法觀察GSTπ轉染后，對體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細胞生長和增殖的影響；(4)劃痕實驗和Boyden小室法用于觀察GSTπ轉染后宮頸癌細胞系HeLa轉移及侵襲能力的改變；(5)細胞接受不同劑量的χ射線照射后，應用

3、克隆形成實驗檢測GSTTπ對HeLa細胞輻射敏感性的影響；(6)采用流式細胞術分析GSTπ對HeLa細胞周期進程的影響；Western Blot法檢測GSTπ對調控細胞周期、DNA損傷修復相關基因或蛋白表達水平的影響。 結果：(1)經限制性內切酶酶切和DNA序列分析證實GSTπ真核表達載體構建成功；(2)經RT-PCR和Western Blot證實G418篩選得到的陽性克隆中GSTπ高表達，表明GSTπ高表達的細胞株篩選成功；(

4、3)細胞計數結果表明GSTπ高表達可以明顯抑制宮頸癌HeLa細胞的生長和增殖；(4)劃痕實驗和Boyden小室法結果顯示高水平GSTπ明顯降低宮頸癌HeLa細胞的轉移和侵襲能力；(5)克隆形成實驗的結果說明GSTπ高水平表達可降低宮頸癌HeLa細胞對X射線的輻射敏感性；(6)流式細胞術分析結果表明GSTπ高表達可導致HeLa細胞在G0/G1期的阻滯。Western Blot法檢測出GSTπ明顯增加細胞周期G1期調控因子cyclin D1

5、和細胞轉移相關抑制蛋白PTEN的表達。 結論：本實驗發(fā)現(xiàn)外源性Gstπ基因轉染提高Gstπ表達水平可以抑制宮頸癌HeLa細胞的生長，其中的機制可能與其降低cyclin D1的蛋白表達，從而引發(fā)細胞周期阻滯有關。GSTπ高水平表達還可明顯抑制HeLa細胞的轉移和侵襲能力，這可能與其上調腫瘤轉移抑制基因PTEN的蛋白表達水平有關。此外，GSTπ高表達使HeLa細胞的輻射敏感性降低。其機制可能是通過調控細胞周期調節(jié)蛋白cyclinB1