E6AP基因在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、本文應(yīng)用RNA干擾技術(shù)化學(xué)合成siRNA及構(gòu)建短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達(dá)質(zhì)粒，研究其作用于E6AP基因后對(duì)E6AP基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響，對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。同時(shí)對(duì)比干擾前后hTERT表達(dá)和端粒酶活性的變化，探討E6AP與hTERT的關(guān)系。研究E6AP基因在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用和意義，為宮頸癌的基因診斷和藥物治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究材料和方法： 1、半定量

2、RT-PCR法。選取2004年5月至2006年5月中國醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)切除和活檢的浸潤宮頸癌標(biāo)本35例，選擇慢性宮頸炎組織、CIN組織各10例，按Trizol試劑盒說明進(jìn)行組織總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。E6AP引物序列：5’-AATCCTGCAGACTTGAAGAA-3’和5’-TCCACATICCCTTCATACTC-3’。PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件：93℃變性1min后，以93℃30s、56℃30s、72℃45s的

3、順序循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。 2、體外合成siRN,A。模板設(shè)計(jì)采用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具，每對(duì)模板長29個(gè)堿基，含與T7啟動(dòng)子序列互補(bǔ)的8個(gè)堿基和與靶基因?qū)?yīng)的21個(gè)堿基。用AmbionSilencerTM siRNA Construction Kit合成21個(gè)堿基的正義鏈和反義鏈RNA并退火形成雙鏈RNA。E6APsiRNA如下：Antisense：5’-UALJCUCAGAGCAGGAGUUG

4、UU-3’，Sense：5’-CAACACCUGCUCUGAGAUAUU-3’； Non-sense control： Antisense：5’-AGGUGACUAGCACUGUUAGUU-3’，Sense：5’-GUAACAGUGCUAGUCACCUUU-3’。 3、shRNA的設(shè)計(jì)和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)GenBank報(bào)道的E6AP序列，利用Ambion公司提供的軟件設(shè)計(jì)E6AP基因的RNAi序列，中間loop環(huán)序列選用：

5、TTCG四個(gè)堿基，兩側(cè)為與載體連接的酶切位點(diǎn)序列。RNAi-E6AP模板：A：5’-TCGACCAACTCCTGCTcTGAGATATTCGTATCTCAGAGCAGGAGTTGTTTTTTT A-3’：B：5’-AGCTT AAAAA AACAACTCCTGCTCTGAGA ACGAATATCTCAGAGCAGGAGTTGG-3’。RNAi．Non-sense模板：A：5’-TCGACCTAACAGTG CTAGTCACCTTTCGA

6、GGTGA CTAG CACTGTTAGTTTTTTTA．3’：B：5’-AGCTTAAAAAAACTAACAGT GCTAGTC ACCTCGAA AGGTGA CTAGCACTG TTAGG-3’。合成DNA序列退火成雙鏈DNA。 SaⅡ/HindⅢ酶切質(zhì)粒，1％瓊脂糖電泳后回收載體，然后與RNAi-E6AP模板連接，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性克隆后提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 4、細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)

7、染。Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、1％雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液。利用轉(zhuǎn)染試劑TransMessenger轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的siRNA。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。 5、半定量RT-PCR。各組細(xì)胞加入Trizol試劑提取總RNA。反應(yīng)條件為：93℃變性1min后，以93℃30s、56℃ 30s、72℃ 45s的順序循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。E6AP引物序列：5’-AATCCTG

8、CAGACTTGAAGAA-3’和5’-TCCACATTCCCTTCATAC TC-3’。以β-肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)對(duì)照，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線照相并進(jìn)行分析。 6、E6AP蛋白質(zhì)的檢測(cè)。采用蛋白印跡法，細(xì)胞經(jīng)4％十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解，勻漿，離心，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量。各組樣本分別取總蛋白質(zhì)300μg，經(jīng)10％SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。與特異性單克隆一抗4℃過夜。

9、與二抗室溫孵育2h后，ECL顯色。 7、噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖。各組細(xì)胞胰酶消化，稀釋成2 X 10<'5>/ml濃度，加入96孔板中，設(shè)3重復(fù)孔，培養(yǎng)12h，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5min，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。在入=570 nm處測(cè)定吸光度。 8、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。按照Anexin V流式細(xì)胞儀檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作。收集細(xì)胞，在PBS中洗滌，Annexin

10、 V抗體及PI標(biāo)記后，用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。 9、hTERTmRNA的檢測(cè)。應(yīng)用半定量RT-PCR法，反應(yīng)條件為：93℃變性1min后，以93℃30s、55℃30s、72℃45s的順序循環(huán)32次，最后72℃延伸10min。引物序列：5’-GTGGATGATTTCTTGTTGT-3’：5’-GCAGGAGGATCTTGTAGATG-3’，以β-肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)對(duì)照。hTERT/β-ac

11、tin光密度比值作為hTERT mRNA的表達(dá)水平。 10、TRAP-PCR-ELISA。細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)，分別收集各組細(xì)胞，依據(jù)TRAP式劑盒提供的方法進(jìn)行檢測(cè)，每份標(biāo)本同時(shí)在酶標(biāo)儀上讀取A450和A690吸收值，根據(jù)△A=A450-A690計(jì)算結(jié)果，△A值代表細(xì)胞端粒酶活性。 研究結(jié)果： 1、通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)組織中E6AP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E6AP基因在慢性宮頸炎、CIN組織、癌性組織中均有表達(dá)。宮頸癌組

12、的表達(dá)量高于慢性宮頸炎組和CIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E6AP基因表達(dá)隨著疾病臨床分期的進(jìn)展而增加，Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)與Ⅲ期的表達(dá)相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。而與腫瘤的類型、大小、組織分化、是否存在淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。 2、體外合成特異性E6APsiRNA轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞系，檢測(cè)干涉效果表明siRNA有效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并抑制基因的表達(dá)，細(xì)胞增殖明顯抑制，凋亡明顯增加，hTERT、基因表達(dá)明顯下調(diào)，端粒酶活

13、性明顯降低，隨著干涉效果的消失逐漸恢復(fù)。 3、成功構(gòu)建靶向E6AP基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，通過質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)合成的siRNA基因序列正確，符合要求。pNeo-RNAi-E6AP表達(dá)載體有效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并抑制功能基因的表達(dá)，細(xì)胞增殖明顯抑制，凋亡明顯增加，hTERT、基因表達(dá)明顯下調(diào)，端粒酶活性明顯降低。干涉后第20天，干涉效果與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干涉時(shí)間明顯延長。 研究結(jié)論： 1、E6AP基因在