受體編輯在天然多反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、天然自身抗體（naturalautoantibody,NAA）是指在沒有任何抗原免疫的情況下，正常機(jī)體中針對(duì)一種或多種自身抗原的自身抗體；產(chǎn)生NAA的B細(xì)胞則被稱為天然自身反應(yīng)性B細(xì)胞。NAA及天然自身反應(yīng)性B細(xì)胞廣泛存在并發(fā)揮重要功能，大量研究提示，自身反應(yīng)性B細(xì)胞存在的耐受機(jī)制與自身免疫病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。
　　受體編輯現(xiàn)象是自身反應(yīng)性B細(xì)胞的發(fā)育耐受的主導(dǎo)機(jī)制。受體編輯通過多種作用方式，一方面保證了人體外周中具有自身反應(yīng)性

2、的B細(xì)胞比例與骨髓相比大大降低；另一方面，發(fā)生了受體編輯從而改變特異性的自身反應(yīng)性B細(xì)胞可以逃脫克隆清除或失活的命運(yùn)而發(fā)育成熟。但是，受體編輯現(xiàn)象作為B細(xì)胞發(fā)育耐受的核心機(jī)制，其參與病理性自身免疫即自身免疫病的方式存在巨大爭(zhēng)論。因此，研究生理性天然多反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育中受體編輯的作用必將有助于全面揭示自身免疫失耐受的真正原因。
　　本課題組以往的研究進(jìn)展，為深入研究受體編輯現(xiàn)象在自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育中的作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。應(yīng)用

3、未免疫小鼠B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，我們成功篩選到了分泌抗角蛋白、肌動(dòng)蛋白等多種自身抗原的自身抗體的3B4等雜交瘤，其中由未免疫小鼠獲得的3B4天然多反應(yīng)性抗體是一種完全意義上的NAA，而表達(dá)3B4抗體的B細(xì)胞可以代表生理廣泛存在的天然自身反應(yīng)性B細(xì)胞。通過克隆3B4可變區(qū)基因，我們成功構(gòu)建了可以表達(dá)天然多反應(yīng)性BCR的3B4重鏈（TgVH3B4）和輕鏈（TgVL3B4）轉(zhuǎn)基因小鼠?？贵w轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，為深入研究自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育耐受

4、提供了理想的平臺(tái)。而來源于未免疫小鼠天然自身反應(yīng)性IgM的3B4抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，為深入研究受體編輯在天然自身反應(yīng)B細(xì)胞發(fā)育中的作用機(jī)制等問題提供了絕佳模型。
　　本研究通過交配重鏈與輕鏈小鼠，在其子代中篩選到了完整表達(dá)天然多反應(yīng)性3B4抗體的轉(zhuǎn)基因重輕鏈小鼠（TgVH/L3B4）。TgVH/L3B4小鼠中表達(dá)轉(zhuǎn)基因完整BCR的B細(xì)胞復(fù)制了3B4抗體分泌細(xì)胞在野生小鼠中的發(fā)育過程；而表達(dá)內(nèi)源輕鏈的TgVH3B4小鼠由于表達(dá)轉(zhuǎn)基因重鏈

5、與不同內(nèi)源輕鏈所組成的BCR，更有利于觀察不同特異性自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育耐受的普遍規(guī)律。利用這個(gè)平臺(tái)，通過比較研究TgVH3B4小鼠和TgVH/L3B4小鼠，我們就受體編輯中的等位相容現(xiàn)象對(duì)自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育分化及其功能的影響進(jìn)行了分析。
　　一、受體編輯在天然自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育中的檢測(cè)
　　利用流式分析轉(zhuǎn)基因重鏈與內(nèi)源性重鏈表達(dá)，并且檢測(cè)不同來源B細(xì)胞輕鏈的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)H鏈?zhǔn)笸庵蹷細(xì)胞發(fā)生明顯的重鏈等位相容現(xiàn)象，并且

6、伴隨活躍的輕鏈?zhǔn)荏w編輯，而HL鏈?zhǔn)驜細(xì)胞發(fā)育中并沒有明顯的受體編輯和等位相容現(xiàn)象，始終完整表達(dá)3B4抗體基因。
　　二、轉(zhuǎn)基因小鼠中天然自身反應(yīng)性B細(xì)胞的發(fā)育和分化
　　通過對(duì)骨髓中不同發(fā)育階段的B細(xì)胞的表面標(biāo)記進(jìn)行抗體染色和流式分析，發(fā)現(xiàn)HL鏈?zhǔn)驜細(xì)胞在骨髓中得到陽性選擇；而H鏈小鼠B細(xì)胞在中樞發(fā)育中受到嚴(yán)格的陰性選擇，相應(yīng)階段細(xì)胞發(fā)育受阻并誘導(dǎo)了受體編輯的發(fā)生。同樣利用B細(xì)胞外周不同發(fā)育階段和成熟亞群的不同表型，通過流式

7、和免疫熒光染色，明確了自身反應(yīng)性B細(xì)胞在H鏈?zhǔn)蟮钠⑴K和腹腔分別向邊緣帶（MZ）和B-1方向分化；在HL鏈小鼠表達(dá)3B4的B細(xì)胞則主要發(fā)育為T2’的特殊表型。
　　三、等位相容在自身反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)育中的作用分析
　　同樣利用流式和激光共聚焦等方法，明確了發(fā)生顯著重鏈等位相容的H鏈小鼠中，等位相容可以誘導(dǎo)B細(xì)胞向MZ和B-1a細(xì)胞發(fā)育分化。
　　四、自身反應(yīng)性B細(xì)胞功能狀態(tài)分析
　　體內(nèi)分析：利用ELISA檢測(cè)到H鏈

8、和HL鏈小鼠血清中同時(shí)存在高表達(dá)的天然多反應(yīng)性自身抗體；流式分析發(fā)現(xiàn)H鏈?zhǔn)笾邪l(fā)生等位相容的B細(xì)胞表面活化分子表達(dá)水平升高；凋亡檢測(cè)明確了B細(xì)胞向不同亞群分化由陽性選擇決定。體外分析：通過體外培養(yǎng)不同組織或流式分選的不同亞群B細(xì)胞，明確了天然多反應(yīng)性自身抗體可以同時(shí)來自脾臟和腹腔，并且在H鏈小鼠中，發(fā)生重鏈等位相容的B細(xì)胞可以被抗原刺激而引起胞內(nèi)Ca2+濃度改變，提示BCR信號(hào)通路的活化；并且其可以在體外分泌天然多反應(yīng)性自身抗體。