細(xì)胞外鈣敏感受體在缺氧性肺血管收縮中的作用和機(jī)制.pdf

1、第一部分：
　　目的:研究細(xì)胞外鈣敏感受體(extracellular calcium-sensing receptor,CaSR)在缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)增加中的作用及機(jī)制。
　　方法:原代培養(yǎng)SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs);免疫組織化學(xué)染色和western blot檢測(cè)PASMCs上CaSR的表達(dá)情況;

2、用不同濃度的細(xì)胞外Ca2+處理PASMCs檢測(cè)CaSR功能;用鈣離子熒光探針Fura-2/AM和熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)[Ca2+]i;用H2-DCFDA和mito-RoGFP檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成;shRNA基因技術(shù)干擾CaSR、STIM1和RyR3的表達(dá),并用western blot檢測(cè)干擾效率。
　　結(jié)果:(1)免疫組織化學(xué)染色和western blot均檢測(cè)到PASMCs細(xì)胞

3、膜和胞漿CaSR表達(dá),western blot結(jié)果顯示細(xì)胞膜和胞漿中CaSR的分子量分別為55-72kD和170kD左右。
　　(2)用4、6、7.5mM細(xì)胞外Ca2+處理PASMCs,可誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化水平逐漸增強(qiáng),同時(shí)6mM和7.5mM細(xì)胞外Ca2+又可以引起[Ca2+]i顯著增高,而此效應(yīng)可被CaSR特異性阻滯劑Calhex231所抑制。
　　(3)缺氧可誘導(dǎo)PASMCs ROS產(chǎn)生增加,用外源性H2O2校正并模

4、擬,缺氧誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生相當(dāng)于15.6mM H2O2誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。
　　(4)缺氧以及15.6mM H2O2均能引起PASMCs[Ca2+]i升高,同時(shí)Calhex231和shRNA-CaSR能抑制缺氧以及15.6mM H2O2引起的[Ca2+]i升高。
　　(5)線粒體DNA剔除不僅抑制缺氧引起的ROS生成增多,也抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,這種效應(yīng)能被外源性15.6mM H2O2所逆轉(zhuǎn),Calhex231和shR

5、NA-CaSR又能夠阻止H2O2對(duì)上述反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用。同時(shí)PEG-catalase預(yù)處理PASMCs能夠抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,而PEG-SOD預(yù)處理則無(wú)此作用。
　　(6)100mM ryanodine抑制RyR功能,可以減弱缺氧和15.6mM H2O2引起的[Ca2+]i升高,但是IP3R的抑制劑20mM XeC卻無(wú)此作用;若同時(shí)應(yīng)用PKA抑制劑H-89,則100mM ryanodine不再抑制缺氧和H2O2引起的[

6、Ca2+]i增加,20mM XeC卻可以抑制此反應(yīng)。儲(chǔ)庫(kù)操縱性鈣離子進(jìn)入(store-operated Ca2+entry,SOCE)抑制劑50mM SKF96365可顯著抑制缺氧和15.6mM H2O2引起的[Ca2+]i升高。此外,STIM1和RyR3基因敲除也可減弱缺氧和H2O2引起的[Ca2+]i升高。
　　結(jié)論:缺氧刺激引起PASMCs線粒體源性H2O2產(chǎn)生增加,增加的H2O2可以使CaSR敏感性增強(qiáng),從而被細(xì)胞外Ca2

7、+激活,進(jìn)而引起RyR敏感性鈣通道開(kāi)放,鈣庫(kù)Ca2+釋放,并激活SOCE,通過(guò)STIM1介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,共同造成[Ca2+]i升高。
　　第二部分：
　　目的:探討CaSR在離體和在體缺氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV)中的關(guān)鍵作用。
　　方法:慢病毒感染SD大鼠,下調(diào)CaSR蛋白表達(dá);Powerlab四導(dǎo)儀監(jiān)測(cè)離體肺動(dòng)脈張力及大鼠在不同條件下肺動(dòng)脈壓

8、和心輸出量。
　　結(jié)果:(1)將慢病毒包裝的CaSR特異性干擾質(zhì)粒,從SD大鼠尾靜脈注射72小時(shí)后,western blot檢測(cè)CaSR蛋白表達(dá)水平明顯下降。
　　(2)離體實(shí)驗(yàn)中,缺氧和15.6mM H2O2均能引起肺血管張力增加,同時(shí)Calhex231能抑制缺氧以及15.6mMH2O2引起肺血管張力增加。此外,shRNA-CaSR可以抑制缺氧引起的肺血管張力增加。
　　(3)在體實(shí)驗(yàn)中,缺氧可以引起SD大鼠肺動(dòng)脈壓