鈣敏感受體在戊四氮點燃慢性癲癇大鼠模型心肌細胞中的表達及作用機制.pdf

1、癲癇是臨床上常見的慢性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要癥狀是反復(fù)突然發(fā)作意識喪失伴抽搐，嚴(yán)重可伴有腦水腫、心臟損害等全身各器官及系統(tǒng)及損傷。這是由于正常情況下腦通過自主神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)心臟活動，神經(jīng)系統(tǒng)功能異常時，腦對心臟的調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，引發(fā)心臟損害，這種情況在臨床上被稱作腦心綜合征（Brain-Heart Syndrome，BHS）。各種引起顱內(nèi)壓增高的疾病均可引起腦心綜合征改變（又稱腦源性心臟損害），常見的疾病有癲癇、急性顱腦損傷、急性腦血管病、

2、顱內(nèi)炎癥、顱內(nèi)腫瘤及其它各種顱內(nèi)疾患。據(jù)目前統(tǒng)計所知，引發(fā)腦心綜合征的最常見病因之一是顳葉癲癇，在我國，癲癇發(fā)病人數(shù)每年約為人口的25.3/10萬，并且呈現(xiàn)上升趨勢，以世界性常見、多發(fā)癲癇病為例，其中多數(shù)病例可出現(xiàn)心率加快，甚至出現(xiàn)心臟驟停導(dǎo)致死亡。因此，腦心綜合征的研究，對于臨床的治療具有重要意義。鈣敏感受體（CaSR）的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到Ca2+同樣可以作為細胞外第一信使發(fā)揮類似激素的作用。鈣敏感受體(CaSR)是屬于G蛋白偶聯(lián)受體C

3、家族成員，由Brown EM等人在1993年首先從牛甲狀旁腺克隆出來，隨后發(fā)現(xiàn)甲狀腺、腸道、腎臟、肝臟及中樞神經(jīng)等組織及器官中也有鈣敏感受體廣泛存在，2003年Wang等人首次在大鼠心肌組織中發(fā)現(xiàn)CaSR表達。研究表明，CaSR可以識別細胞外Ca2+的細微變化，并保證時刻調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)，同時在維持機體Ca2＋穩(wěn)態(tài)和其它金屬離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且參與調(diào)節(jié)激素分泌，細胞增殖、分化、凋亡、基因表達，離子通道開放等過程。2012年，郭

4、津人等證實，CaSR參與了大鼠心肌缺血/再灌注損傷、心肌肥大的發(fā)生。目前，癲癇大鼠心肌細胞中 CaSR表達及其作用通路情況尚未見報道。
　　目的：通過觀察戊四氮誘導(dǎo)的慢性癲癇大鼠模型的心肌細胞中CaSR表達，證明癲癇大鼠心肌細胞中有CaSR表達及其在細胞凋亡中與線粒體的關(guān)系。
　　方法：清潔級雄性 Wistar大鼠，體重180±10克，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供。隨機分為正常組（control group，n=12)，癲癇

5、組（epilepsy group，n=12)。癲癇組采用連續(xù)28天腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮生理鹽水注射液35mg/ kg.d（pentetrazole PTZ)，建立慢性癲癇大鼠模型。注射后觀察抽搐發(fā)作情況，記錄癲癇發(fā)作的級別、發(fā)作潛伏期(s)(即注入 PTZ到首次癇性發(fā)作之間經(jīng)歷的時間)及發(fā)作持續(xù)時間(s)，凡出現(xiàn)Ⅲ級以上癇性發(fā)作的大鼠為模型制備成功（癲癇大鼠行為分級按 Racine分級法）。腦電圖檢測大腦異常放電情況。心臟彩超檢測心

6、率、左心室縮短分?jǐn)?shù)和左室射血分?jǐn)?shù)。采用德國臨床化學(xué)學(xué)會（DGKC）推薦法檢測血清肌酸激酶(CK)、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）。HE染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化；電鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)變化。Western bloting分別觀察心肌CaSR、Bcl-2、Caspase3和Bax的蛋白表達情況。
　　結(jié)果：腦電檢查正常組未見異常變化，癲癇組腦電圖可見明顯節(jié)律失調(diào)，可見尖波及棘波改變，提示癲癇組造模成功。經(jīng)胸高頻超聲心動圖能清晰顯示大鼠的

7、左室長軸切面，正常組心率348次/分，M型曲線顯示左室壁節(jié)律規(guī)整，癲癇組大鼠心率461次/分，M型曲線顯示左室壁節(jié)律失調(diào)。左心室縮短分?jǐn)?shù)（FS）正常值35％-84%，正常組及癲癇組處于正常范圍之內(nèi)；左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）正常值55%-65%，正常組結(jié)果處于正常范圍，癲癇組EF值降低。血清酶結(jié)果顯示，癲癇組CK、CK-MB檢測結(jié)果高于正常組（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠心肌細胞在光鏡下觀察：正常組細胞排列整齊，細胞核及橫紋清楚；癲

8、癇組見細胞排列紊亂，橫紋不清，并見肌節(jié)的攣縮，部分細胞胞漿溶解消失，可見液化性壞死，部分細胞心肌纖維溶解，出現(xiàn)凝固性帶狀壞死，部分細胞核碎裂消失。在透射電鏡下見正常組心肌細胞的肌絲排列規(guī)則,橫紋清晰，細胞核完整，線粒體豐富且嵴密集。癲癇組肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，橫紋模糊，線粒體嵴部分呈溶解狀態(tài)，細胞核固縮，染色質(zhì)邊集化。證明癲癇組大鼠心肌細胞出現(xiàn)壞死及凋亡，線粒體部分損傷明顯。Western bloting方法檢測CaSR、Bax、Bcl-2和C

9、aspase-3蛋白表達癲癇組心肌中 CaSR表達高于正常組（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。癲癇組的Bcl-2蛋白表達低于正常組（P＜0．05)具有統(tǒng)計學(xué)意義。癲癇組Caspase-3的蛋白表達明顯高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。癲癇組 Bax的蛋白表達明顯高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用PTZ點燃癲癇大鼠模型目前應(yīng)用最為廣泛，連續(xù)28天腹腔注射 PTZ后，癲癇組大鼠顯示連續(xù)出現(xiàn)Ⅲ級以上癲癇發(fā)作，同時觀察到腦電圖出現(xiàn)節(jié)律異常，并可見尖波及

10、棘波的出現(xiàn)，證明造模成功。癲癇組大鼠心臟彩超下見心率明顯增快，左室射血分?jǐn)?shù)降低，證明癲癇組出現(xiàn)心臟損害改變。血清酶檢測中CK及CK-MB是提示心肌損傷的早期標(biāo)志物，對心肌損傷具有高特異性及高靈敏性的特點。本實驗癲癇組CK及CK-MB結(jié)果較正常組明顯增高（p<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合心肌組織鏡下觀察，見細胞結(jié)構(gòu)紊亂，細胞腫脹，細胞核碎裂；電鏡下見橫紋模糊，線粒體嵴部分呈溶解狀態(tài)，細胞核固縮，染色質(zhì)邊集化，充分證明癲癇組存在心肌損害

11、及心肌細胞凋亡改變。
　　結(jié)論：本實驗研究結(jié)果表明，PTZ誘導(dǎo)癲癇可導(dǎo)致大鼠心肌損傷，心肌組織中CaSR表達增加，CaSR激活后并通過線粒體內(nèi)源性途徑，激活 Cyt-C-Caspase3途徑參與細胞凋亡有關(guān)，并且證明，CaSR激活可抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達，激活促凋亡 Bax蛋白表達，從而導(dǎo)致細胞凋亡。CaSR的表達上調(diào)可增加心肌損傷的易感性，因此，下調(diào)CaSR的表達，對于癲癇患者的心肌保護，預(yù)防腦心綜合癥是進一步研究的重