戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶改變及GAP-43的表達(dá)變化.pdf

1、目的:臨床發(fā)現(xiàn)30％～40％的癲癇患者除癲癇反復(fù)發(fā)作癥狀外,常伴有記憶力減退、注意力分散、情感行為異常及社會(huì)適應(yīng)能力下降等多種認(rèn)知功能受損的表現(xiàn),嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。癲癇與認(rèn)知功能損害的關(guān)系已引起人們廣泛重視,并已經(jīng)成為現(xiàn)代癲癇病學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,然而癲癇對(duì)認(rèn)知功能損害的確切機(jī)制還不清楚。一般認(rèn)為,基礎(chǔ)病因和常用的抗癲癇藥物的副作用是引起認(rèn)知功能損害的誘因,近些年研究表明,癇性發(fā)作本身也是癲癇患者認(rèn)知損害的主要原因。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔

2、注射戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)建立起穩(wěn)定的慢性癲癇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型并給予NMDA受體拮抗劑美金剛(memantine,MMT)加以干預(yù),應(yīng)用Morris水迷宮觀察癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶變化,利用免疫組化及RT-PCR方法檢測(cè)GAP-43蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的變化,并進(jìn)一步研究美金剛對(duì)學(xué)習(xí)記憶的改善作用,探討癲癇后認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。
　　 方法:選用健康雄性SD大鼠,經(jīng)兩次Y-迷宮篩選合格后獲得110只大鼠,隨機(jī)

3、分五組,NC組(20只)大鼠每日腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共44d。PTZ組(30只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min腹腔注射生理鹽水3.5 ml/kg,共14 d。PTZ+MMT(5)組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT5 mg/kg,共14d。PTZ+MMT(10)

4、組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT10mg/kg,共14d。PTZ+MMT(15)組(20只)每日腹腔注射1％PTZ35 mg/kg,連續(xù)44 d,自給藥第31天起,每日PTZ注射前30 min分別腹腔注射MMT15mg/kg,共14d。造模成功后采用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的測(cè)試。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法和

5、免疫組化方法分別測(cè)定大鼠NC組和PTZ組海馬GAP-43 mRNA和蛋白的水平變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、行為學(xué)觀察PTZ組大鼠在注射PTZ后第3～7天起開始出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、反復(fù)洗臉動(dòng)作、面部及頭部抽搐等,以后發(fā)作癥狀逐日加重,于給藥第16～24天出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起,跌倒,最終發(fā)生全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作,達(dá)到RacineⅣ～Ⅴ級(jí)的點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn),每次強(qiáng)直-陣攣發(fā)作持續(xù)數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘不等。大鼠連續(xù)三次RacineⅣ～

6、Ⅴ級(jí)發(fā)作后被認(rèn)為點(diǎn)燃成功,共有大鼠24只完全點(diǎn)燃。PTZ+MMT(5)組:應(yīng)用PTZ30天時(shí)大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有15只大鼠完全點(diǎn)燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級(jí)程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā),作后緩解時(shí)間均縮短。PTZ+MMT(10)組:應(yīng)用PTZ30天時(shí)大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有16只大鼠完全點(diǎn)燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級(jí)程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作后緩解時(shí)間均縮短

7、。PTZ+MMT(15)組:應(yīng)用PTZ30天時(shí)大鼠表現(xiàn)同單純PTZ組,共有14只大鼠完全點(diǎn)燃;后14天PTZ注射前給予MMT,大鼠癲癇發(fā)作Ⅳ～Ⅴ級(jí)程度基本未變,但發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作后緩解時(shí)間均縮短,但有2只死亡。NC組無癲癇發(fā)作表現(xiàn)。
　　 2、Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果
　　 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果:每日逃避潛伏期取其平均值進(jìn)行比較,結(jié)果顯示(1)實(shí)驗(yàn)第1天,五組大鼠逃避潛伏期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(2)實(shí)驗(yàn)第2

8、天,各組逃避潛伏期均比第一天明顯縮短,與NC組的逃避潛伏期(14.36±4.09)s比較,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(23.85±5.66)s明顯延長(zhǎng)(P＜0.01),PTZ+MMT(5)組(20.90±5.84)s和PTZ+MMT(15)組(21.20±5.23)s長(zhǎng)于NC組(P＜0.05);PTZ+MMT(10)組的逃避潛伏期(14.97±3.23)s長(zhǎng)于NC組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15

9、)長(zhǎng)于PTZ+MMT(10),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)實(shí)驗(yàn)第3天,與NC組(8.14±1.38)s比較,PTZ組大鼠的逃避潛伏期(15.51±1.27)s延長(zhǎng)(P＜0.01),PTZ+MMT(5),PTZ+MMT(10)和PTZ(15)組分別為(12.35±1.87)s,(9.78±2.23)s,和(14.98±1.54)s比NC組延長(zhǎng)(P＜0.05),PTZ+MMT(10)與PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15)相比

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 空間探索試驗(yàn)結(jié)果:PTZ組大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)(2.37±0.60)明顯低于NC組(5.17±1.39)(P＜0.01);PTZ+MMT(5)組和PTZ+MMT(15)組分別為(3.52±1.09)和(3.40±0.47)低于NC組(P＜0.05);PTZ+MMT(10)組為(4.68±1.28)雖低于NC組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;PTZ組與PTZ+MMT(10)相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

11、0.01),與PTZ+MMT。(5)和PTZ+MMT(15)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　 在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間為:NC組(23.57±4.75)s,PTZ組(18.58±1.52)s,PTZ+MMT(5)(19.67±3.34)s,PTZ+MMT(10)組(22.64±3.25)s,PTZ+MMT(15)組(19.27±2.26)s四組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3、GAP-43 mRNA的表達(dá)PTZ組大鼠海馬GA

12、P-43 mRNA/β-actin mRNA表達(dá)(0.591±0.075)與NC組(0.817±0.051)相比降低,兩者有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、采用免疫組化方法檢測(cè)PTZ組和NC組標(biāo)本大鼠GAP-43蛋白在海馬CA1區(qū)和DG區(qū)表達(dá)
　　 NC組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)可見彌散分布的GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物,為細(xì)小的棕褐色顆粒,神經(jīng)元胞膜染色最深,呈棕黃色,斑點(diǎn)狀。PTZ組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)亦可見

13、散在分布的GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物,與NC組相比,陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,而且染色較淺。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)建立的戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型存在學(xué)習(xí)和記憶能力缺損,表現(xiàn)為逃避潛伏期延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)減少和平臺(tái)象限游泳時(shí)間無明顯改變,美金剛可以改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙,以10mg/kg最佳。
　　 2、與對(duì)照組比較,戊四氮慢性點(diǎn)燃癲癇組大鼠海馬神經(jīng)GAP-43mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降,在海馬CA1和DG區(qū)免疫