GRK4調(diào)節(jié)D1受體在胰島素抵抗及AT1受體在血管反應(yīng)性中的作用及機(jī)制.pdf

1、1.骨骼肌G蛋白偶聯(lián)受體激酶4調(diào)節(jié)多巴胺D1受體在運(yùn)動(dòng)降低胰島素抵抗中的作用及機(jī)制
　　胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是2型糖尿病最重要的發(fā)病機(jī)制和特點(diǎn)之一。此外,胰島素抵抗同樣是高血壓、冠心病和腦卒中等多種心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。各種心血管疾病和胰島素抵抗之間相互作用,形成惡性循環(huán)而危害機(jī)體的健康。因此,改善生活方式和藥物干預(yù)對(duì)胰島素抵抗進(jìn)行預(yù)防和控制是非常重要的。
　　除了肝臟以外,肌肉組織

2、是胰島素作用最主要的靶器官。因此運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是除了飲食控制和藥物以外改善胰島素抵抗最主要的治療方法之一。運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗的作用機(jī)制主要在于組織毛細(xì)血管數(shù)量增加,平衡血脂以及控制炎癥因子和氧化應(yīng)激。運(yùn)動(dòng)可以顯著的增高腎臟D1受體的表達(dá),但對(duì)肌肉是否有相同的作用并不明確。前期研究顯示,多巴胺D1受體在機(jī)體血糖及血胰島素的調(diào)節(jié)中具有重要的作用。多巴胺D1受體激動(dòng)劑非諾多泮(fenoldopam)和SKF38393均可改善2型糖尿病的胰島素抵抗癥

3、狀,但機(jī)制尚不明確。
　　作為G蛋白偶聯(lián)受體,多巴胺受體家族受到G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase, GRK)家族的調(diào)節(jié)。GRKs與胰島素抵抗具有密切的關(guān)系。而GRK4在胰島素抵抗的發(fā)生中具有何種作用,尚不清楚。GRK4已被證實(shí)對(duì)于多巴胺D1受體功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此,我們推測GRK4可能在骨骼肌上存在表達(dá),并通過調(diào)節(jié)多巴胺D1受體,參與運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗的調(diào)節(jié)。
　　

4、為證實(shí)上述假設(shè),本實(shí)驗(yàn)采用了STZ和高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,以動(dòng)物及骨骼肌C2C12細(xì)胞為研究對(duì)象,研究:(1)多巴胺D1受體在骨骼肌的表達(dá)情況;(2)骨骼肌多巴胺D1受體在運(yùn)動(dòng)改善IR中的作用;(3)多巴胺D1受體改善IR的信號(hào)通路;(4)骨骼肌上GRK4與巴胺D1受體的相互作用。
　　1.1主要實(shí)驗(yàn)方法及步驟:
　　1.1.1骨骼肌組織及細(xì)胞存在多巴胺D1受體的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)利用

5、C57BL/6小鼠后肢股二頭肌肌組織及小鼠骨骼肌前體細(xì)胞系C2C12細(xì)胞,利用免疫組織化學(xué)法以及免疫印跡法分別從形態(tài)學(xué)分布和蛋白水平分析多巴胺D1受體在骨骼肌組織及細(xì)胞上的分布情況。
　　1.1.2骨骼肌多巴胺D1受體在運(yùn)動(dòng)改善IR中的作用
　　實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠和小鼠骨骼肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞,構(gòu)建整體動(dòng)物和骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗模型,通過C57BL/6小鼠在體運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)及電刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮模型,在不同研究水平分析

6、多巴胺D1受體對(duì)C2C12細(xì)胞胰島素抵抗中的作用。
　　1.1.3骨骼肌多巴胺D1受體對(duì)IR改善作用的信號(hào)通路
　　本部分實(shí)驗(yàn)利用骨骼肌C2C12細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞胰島素抵抗模型,觀察不同劑量和不同處理時(shí)間點(diǎn)多巴胺D1受體激動(dòng)劑fenoldopam對(duì)骨骼肌C2C12細(xì)胞糖攝取的影響。檢測多巴胺D1受體激動(dòng)劑fenoldopam對(duì)Akt磷酸化程度的變化和GLUT4轉(zhuǎn)位的變化。
　　1.1.4骨骼肌GRK4對(duì)多巴胺D1受體的調(diào)節(jié)

7、作用
　　實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠后肢股二頭肌肌組織及小鼠骨骼肌前體細(xì)胞系C2C12細(xì)胞,利用免疫組織化學(xué)法以及免疫印跡法分別從形態(tài)學(xué)分布和蛋白水平分析GRK4在骨骼肌組織及細(xì)胞上的分布情況,并進(jìn)一步分析GRK4和多巴胺D1受體在胰島素抵抗情況及電刺激收縮情況下的相互關(guān)系。利用GRK4轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌組織研究在GRK4活性增加的條件下,多巴胺D1受體表達(dá)量的改變。明確骨骼肌GRK4對(duì)多巴胺D1受體的調(diào)節(jié)作用。
　　1.2

8、主要研究成果:
　　1.2.1多巴胺D1受體在骨骼肌組織及細(xì)胞上存在表達(dá)
　　多巴胺D1受體在骨骼肌組織上存在表達(dá),分布于骨骼肌肌纖維上。
　　1.2.2骨骼肌多巴胺D1受體在運(yùn)動(dòng)改善IR中的作用
　　運(yùn)動(dòng)呈時(shí)間依賴性的降低2型糖尿病小鼠的血糖和血清胰島素水平。血糖水平在運(yùn)動(dòng)2周出現(xiàn)顯著下降,血清胰島素水平在運(yùn)動(dòng)1至4周后均出現(xiàn)了顯著下降,而1至4周的小鼠跑步機(jī)訓(xùn)練也降低了穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。在

9、跑步訓(xùn)練前連續(xù)給予SCH23390腹腔后,運(yùn)動(dòng)不能改善STZ及高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠的高血糖和高胰島素。STZ及高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗顯著降低了小鼠骨骼肌多巴胺D1受體蛋白表達(dá),而運(yùn)動(dòng)1至4周可顯著增高小鼠骨骼肌多巴胺D1受體蛋白表達(dá)。在細(xì)胞水平,骨骼肌C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型對(duì)葡萄糖的攝取能力顯著下降,對(duì)葡萄糖的攝取隨著15min至1h電刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞被動(dòng)收縮呈時(shí)間依賴性的增強(qiáng)。10-5M多巴胺D1受體抑制劑SCH2339

10、0阻斷了高頻電刺激引起骨骼肌C2C12細(xì)胞收縮誘導(dǎo)的葡萄糖攝入。多巴胺D1受體的膜表達(dá)與電刺激收縮呈時(shí)間依賴性的增強(qiáng)。
　　1.2.3骨骼肌多巴胺D1受體對(duì)IR的改善作用依賴于Akt-Glut4信號(hào)通路
　　骨骼肌C2C12細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量對(duì)fenoldpam呈劑量依賴性的增高;在短時(shí)刺激下,10-6M-10-5 M的fenoldpam具有顯著的作用;在長時(shí)刺激下,10-7M-10-5 M的 fenoldpam有顯著作用

11、。細(xì)胞Akt的磷酸化水平在使用胰島素刺激后顯著增加;而PA的處理對(duì)胰島素的信號(hào)通路具有明確的損傷作用,無論是否利用胰島素刺激均顯著降低了Akt的磷酸化程度;而多巴胺D1受體激動(dòng)劑fenoldpam可顯著的提高Akt的磷酸化程度,這一作用并不依賴于胰島素。GLUT4轉(zhuǎn)位在胰島素刺激后顯著增加;而PA的處理對(duì)GLUT4轉(zhuǎn)位具有明確的損傷作用,多巴胺D1受體激動(dòng)劑fenoldpam通過增加GLUT4的膜表達(dá)增加糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　1.2.4骨

12、骼肌GRK4對(duì)多巴胺D1受體的調(diào)節(jié)作用
　　GRK4在骨骼肌組織及細(xì)胞上存在表達(dá)。而胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,GRK4的表達(dá)顯著下降,短時(shí)間的骨骼肌細(xì)胞收縮不能改變GRK4的表達(dá),但改變了GRK4與骨骼肌多巴胺D1受體的相互作用,增加了多巴胺D1受體的膜聚集。此外,GRK4活性增高可降低骨骼肌多巴胺D1受體的表達(dá)。
　　1.3結(jié)論:
　　1.3.1在骨骼肌組織及骨骼肌細(xì)胞上存在多巴胺D1受體的表達(dá)。
　　1.3.2.長期

13、運(yùn)動(dòng)可以增加骨骼肌上的多巴胺D1受體的蛋白表達(dá),而急性的骨骼肌收縮可增加多巴胺D1受體的膜轉(zhuǎn)位,增加受體敏感性;多巴胺D1受體參與了運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用。
　　1.3.3.多巴胺D1受體通過調(diào)節(jié)Akt的磷酸化,增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4的膜轉(zhuǎn)位改善胰島素抵抗。
　　1.3.4.骨骼肌上存在GRK4;GRK4通過多巴胺D1受體參與對(duì)IR的調(diào)節(jié)。
　　2.血管平滑肌G蛋白偶聯(lián)受體激酶4增強(qiáng)AT1受體介導(dǎo)的血管收縮在高

14、血壓發(fā)病中的作用
　　原發(fā)性高血壓是腦卒中、心肌梗塞以及心腎功能衰竭等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。腎臟、血管和神經(jīng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)尿鈉排泄、外周阻力和大血管彈性調(diào)節(jié)血壓。大多數(shù)的激素和分泌因子通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)調(diào)節(jié)血壓。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK)功能異常導(dǎo)致了受體生理功能的異常,導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。GRK家族成員之一,GRK4具有固有活性,在特定組織表達(dá)。GRK4變異體65L、142V和486V在不同的人群中均與高血壓發(fā)病

15、有關(guān)。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAAS)的活性增高在高血壓發(fā)病中具有重要的作用。在自發(fā)性高血壓大鼠上,腎臟GRK4和AT1受體表達(dá)的共同升高導(dǎo)致了血壓的升高。血管功能在血壓和心功能調(diào)解中具有重要的作用。而GRK4是否通過AT1受體調(diào)節(jié)血管功能而參與血壓的調(diào)節(jié)并不清楚。因此,本研究將就血管平滑肌上GRK4和AT1受體的相互作用進(jìn)行研究。
　　2.1主要實(shí)驗(yàn)方法及步驟:

16、r>　　2.1.1 GRK4在血管上的表達(dá)情況
　　利用免疫熒光染色、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析血管上GRK4的蛋白和mRNA的表達(dá)和分布情況。
　　2.1.2 GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠血管反應(yīng)性的改變
　　在此部分實(shí)驗(yàn)中,我們將分析GRK4g A142V轉(zhuǎn)基因小鼠血管對(duì)Ang II以及坎地沙坦(ARB)收縮反應(yīng)性的改變,以及GRK4g A142V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓的改變,并進(jìn)一步分析GRK4g A142V轉(zhuǎn)基

17、因小鼠血管AT1受體的表達(dá)變化情況。
　　2.1.3 GRK4g變異體142V對(duì)血管平滑肌AT1受體表達(dá)及功能的影響
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)中,我們將對(duì)GRK4g變異體A142V對(duì)血管收縮反應(yīng)性作用的機(jī)制進(jìn)行探討。首先,本部分實(shí)驗(yàn)將觀察Ang II對(duì)轉(zhuǎn)染GRK4g變異體A142V的平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣的刺激作用,以及坎地沙坦對(duì)其的抑制作用。進(jìn)一步的研究將利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析GRK4g變異體A142V對(duì)血管平滑肌蛋白和

18、mRNA表達(dá)的作用;同時(shí),也檢測AT1受體蛋白降解和磷酸化水平的變化情況。此外,我們還利用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦掃描分析GRK4和AT1受體的相互關(guān)系。作為AT1受體啟動(dòng)子的重要調(diào)節(jié)因子,我們還會(huì)分析不同基因型的血管平滑肌細(xì)胞NF-kB和AT1受體啟動(dòng)子結(jié)合的改變,以及NF-kB抑制劑BAY11-7082對(duì)AT1受體表達(dá)的改變。
　　2.2主要研究成果:
　　2.2.1 GRK4在血管平滑肌上的表達(dá)情況
　　首先,我

19、們通過免疫熒光、免疫印跡及RT-PCR實(shí)驗(yàn),證實(shí)GRK4在血管上存在表達(dá)。免疫熒光發(fā)現(xiàn),GRK4在SD大鼠和C57BL/6J小鼠血管中膜和外膜存在表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GRK4存在54 kDa、60 kDa和65 kDa三條條帶,其中僅有60 kDa的條帶在使用GRK4特異性的siRNA干擾后出現(xiàn)減弱。RT-PCR顯示GRK4 mRNA存在表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí) GRK4在血管外膜上存在表達(dá),我們通過免疫印跡和 RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了血管

20、外膜的脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞存在GRK4表達(dá)。去除血管外膜后,不影響Ang II介導(dǎo)的血管收縮。
　　2.2.2 GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓及血管反應(yīng)性的變化
　　為分析GRK4調(diào)節(jié)AT1受體的作用,我們研究AT1受體的蛋白表達(dá)和功能在GRK4野生型和142V轉(zhuǎn)基因小鼠上的區(qū)別。麻醉后的GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠的舒張壓、收縮壓和平均動(dòng)脈壓均高于野生型小鼠。給予小鼠靜脈推注Ang II后,GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠的

21、舒縮壓增高也顯著高于GRK4g野生型小鼠,而坎地沙坦對(duì)血壓的降低作用在GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠上也顯著強(qiáng)于GRK4g野生型小鼠。
　　該部分研究又進(jìn)一步分析了Ang II對(duì)GRK4g野生型和142V轉(zhuǎn)基因小鼠血管反應(yīng)性的影響。Ang II對(duì)GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠血管收縮反應(yīng)性的作用強(qiáng)于對(duì)GRK4野生型小鼠的作用。這一作用不受血管是否存在內(nèi)皮的影響。在使用了10-6M的坎地沙坦處理血管后,血管收縮反應(yīng)性在兩種不同基因型小鼠

22、上并無差別。AT1受體的表達(dá)在GRK4g142V轉(zhuǎn)基因小鼠上顯著高于GRK4g野生型小鼠。
　　2.2.3 GRK4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞AT1受體表達(dá)及功能的作用
　　為進(jìn)一步分析GRK4對(duì)AT1受體的影響,我們使用A10細(xì)胞轉(zhuǎn)染hGRK4g142V變異體進(jìn)行研究。Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增高在hGRK4g142V細(xì)胞上高于hGRK4g野生型細(xì)胞。我們也同樣發(fā)現(xiàn), hGRK4g142V細(xì)胞上AT1受體蛋白和mRNA的表達(dá)顯著高

23、于hGRK4g野生型細(xì)胞;而AT1受體蛋白的降解在hGRK4g142V細(xì)胞上更低。此外,AT1受體磷酸化水平在hGRK4g142V細(xì)胞上低于hGRK4g野生型細(xì)胞。
　　我們也分析了GRK4和AT1受體的共定位和共沉淀。GRK4和AT1受體的結(jié)合作用在在hGRK4g142V細(xì)胞上低于hGRK4g野生型細(xì)胞,這可能是導(dǎo)致AT1受體磷酸化水平在hGRK4g142V細(xì)胞上的原因之一。
　　作為AT1受體啟動(dòng)子活性的調(diào)控子,我們分析

24、了NF-kB與AT1受體啟動(dòng)子的結(jié)合作用,發(fā)現(xiàn)在hGRK4g142V細(xì)胞上NF-kB與AT1受體啟動(dòng)子的結(jié)合作用強(qiáng)于hGRK4g野生型細(xì)胞。而NF-kB阻斷劑BAY11-7082抑制了hGRK4g142V變異體對(duì)AT1受體蛋白的增加作用,提示NF-kB在hGRK4g142V細(xì)胞上對(duì)AT1受體表達(dá)呈正向調(diào)節(jié)。
　　2.3結(jié)論:
　　2.3.1. GRK4在血管平滑肌上存在表達(dá)。
　　2.3.2. GRK4g變異體142V