胰島素受體在棉蚜卵巢發(fā)育及性母形成中的作用.pdf

1、棉蚜(Aphis gossypii)俗稱膩蟲，屬半翅目蚜科，是我國(guó)常見的棉花農(nóng)業(yè)害蟲，在我國(guó)幾乎分布在各個(gè)棉花種植區(qū)。棉蚜根據(jù)其生物學(xué)形態(tài)差異，分有翅與無翅兩種表型。根據(jù)其生殖特點(diǎn)，分為無性孤雌生殖棉蚜：孤雌蚜蟲、產(chǎn)性母蚜蟲、蚜蟲性母；有性生殖棉蚜：性雌和性雄。在自然條件下，棉蚜以卵越冬，當(dāng)溫度升高日照變長(zhǎng)時(shí)，卵便孵化為干母，干母營(yíng)孤雌生殖產(chǎn)生有翅棉蚜，遷飛到夏寄主上營(yíng)孤雌生殖繁殖后代；當(dāng)日照長(zhǎng)度變短，溫度降低開始進(jìn)入秋冬季節(jié)時(shí)，棉蚜中

2、逐漸出現(xiàn)產(chǎn)性母的蚜蟲，而產(chǎn)生的性母則繼續(xù)進(jìn)行孤雌生殖產(chǎn)生性雌，經(jīng)過約兩周性母接著產(chǎn)生性雄，雄蚜接著與性雌棉蚜交配產(chǎn)生卵。因此可以發(fā)現(xiàn)，性母是棉蚜從無性生殖向有性生殖轉(zhuǎn)換非常關(guān)鍵的存在。經(jīng)過我們長(zhǎng)時(shí)間觀察，發(fā)現(xiàn)性母有三個(gè)主要的表型特點(diǎn)，有翅，卵小管退化，體色深且體壁硬。棉蚜的生殖多樣性是一個(gè)典型的由蚜蟲產(chǎn)生的高水平的表型可塑性，我們也可以認(rèn)為是一組相同的基因發(fā)展成為了不同表型。但是其生殖可塑性的分子機(jī)制目前還并不清晰。
　　本研究主

3、要內(nèi)容包括：⑴比較棉蚜在孤雌、產(chǎn)性母蚜蟲、性母和性雌這幾種時(shí)期的胰島素受體表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)與孤雌相比棉蚜性母的胰島素表達(dá)模式顯著升高。在對(duì)棉蚜性母的表達(dá)模式探究中發(fā)現(xiàn)，棉蚜性母在二齡三齡時(shí)期胰島素受體的表達(dá)顯著降低，InR2的表達(dá)模式與 InR1相似。而InR1在產(chǎn)性母棉蚜當(dāng)中的表達(dá)模式從三齡開始逐漸升高，但并沒有顯著性。⑵用帶有T7接頭的引物通過PCR合成雙鏈RNA模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成特定長(zhǎng)度雙鏈RNA。在棉蚜性母當(dāng)中，用水和穿膜蛋白分

4、別對(duì)雙鏈RNA稀釋到濃度為3.3ng/μl，在棉蚜產(chǎn)性母蚜蟲的成蟲和性母三齡時(shí)期分別注射一次，使棉蚜通過注射法產(chǎn)生RNAi。經(jīng)過熒光定量 PCR檢測(cè)，用水直接稀釋雙鏈的方法比用穿膜蛋白稀釋雙鏈的方法更有效的抑制了InR1基因的表達(dá)。其中在棉蚜四齡和成蟲時(shí)期InR1的表達(dá)量最低，下降了70％。并且干擾后的棉蚜有翅的比例降低了84％，但是在卵巢解剖當(dāng)中，并沒有發(fā)現(xiàn)顯著非正常表型。證明通過兩次注射用水稀釋的雙鏈RNA可以在棉蚜成蟲時(shí)期引起棉蚜

5、胰島素受體基因RNAi，但并不能影響其卵巢發(fā)育。⑶在棉蚜產(chǎn)性母蚜蟲當(dāng)中嘗試運(yùn)用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑與雙鏈RNA混合的方式引起棉蚜G1產(chǎn)生RNAi。當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑和雙鏈RNA的比例分別為1:4和1:8,時(shí)，由于轉(zhuǎn)染試劑本身的毒性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組棉蚜幾乎全部死亡。更改實(shí)驗(yàn)條件，選擇比例為1:15，在棉蚜G1三齡和四齡時(shí)期進(jìn)行兩次注射和三次注射。進(jìn)過熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，棉蚜G1在進(jìn)行兩次注射時(shí)，成蟲時(shí)期胰島素受體的表達(dá)量下降，并在第三次注射后

6、的第一天顯著下降了約40%。而對(duì)G1進(jìn)行三次注射時(shí)，成蟲時(shí)期G1的胰島素受體的表達(dá)量也顯示下降，并在第11天顯著下降了70％。說明三次注射比兩次注射的干擾效率高。在三次注射后的棉蚜G1卵巢受到了抑制，實(shí)驗(yàn)組中次胚幾乎不發(fā)育，且這種表型所占比例為75％。證明轉(zhuǎn)染試劑混合雙鏈通過三次注射法對(duì)棉蚜G1進(jìn)行干擾，抑制了G1的卵巢發(fā)育，進(jìn)而抑制了棉蚜性母的產(chǎn)生。⑷實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅印證了前人實(shí)驗(yàn)中胰島素受體影響昆蟲翅形發(fā)育的結(jié)論，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)干擾胰島素受