酪氨酸激酶受體B在冠心病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、論文一、酪氨酸激酶受體B對(duì)內(nèi)皮通透性的影響及其與冠心病的關(guān)系
　　背景：冠心病(Coronary artery disease，CAD)是中老年人常見的一種心血管疾病，其發(fā)病率及死亡率高，而且呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。
　　CAD的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。內(nèi)皮屏障功能異常是AS的始動(dòng)因素而且貫穿AS的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋在血管腔表面形成一層

2、生理屏障，通過內(nèi)皮間連接的結(jié)構(gòu)嚴(yán)格控制著血液中生物大分子及血細(xì)胞的通過，但在某些生理或病理情況下通透性可以大幅度增加。一旦內(nèi)皮通透性增加，隨后將發(fā)生一系列反應(yīng)，如血漿內(nèi)的脂質(zhì)成分通過內(nèi)皮間隙進(jìn)入內(nèi)膜，單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜，進(jìn)一步損傷血管和促進(jìn)AS斑塊的形成甚至引起斑塊破裂。
　　研究表明內(nèi)皮細(xì)胞粘附是關(guān)系內(nèi)皮通透性的關(guān)鍵因素。酪氨酸激酶受體B(Tyrosine kinase receptor B，TrkB)是腦源性神經(jīng)營

3、養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的高親和力受體。研究表明TrkB通路除了在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，也表達(dá)于心血管系統(tǒng)。研究表明TrkB可能參與細(xì)胞粘附，將TrkB穩(wěn)定轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞聚集成團(tuán)，而且聚集只發(fā)生在TrkB和鈣粘蛋白同時(shí)表達(dá)的條件下。內(nèi)皮細(xì)胞粘附除了在血管內(nèi)皮通透性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在血管發(fā)育過程也發(fā)揮重要作用。敲基因鼠研究表明BDNF-TrkB通路確實(shí)影響心臟血管

4、發(fā)育:研究發(fā)現(xiàn)TrkB基因敲除小鼠表現(xiàn)為心肌內(nèi)血管明顯減少和出生后死亡;BDNF敲基因小鼠表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、心肌內(nèi)出血、降低的心臟收縮力和早期出生后死亡;而BDNF-TrkB過表達(dá)則導(dǎo)致小鼠胚胎期心肌內(nèi)毛細(xì)血管的密度顯著增加。TrkB是否影響成年血管內(nèi)皮通透性并參與冠心病的病理過程目前尚不清楚。本研究針對(duì)這一問題，研究TrkB與冠心病是否相關(guān)，以及其對(duì)血管內(nèi)皮通透性的影響及分子機(jī)制。旨在尋找冠心病的新的分子機(jī)制，為冠心病的診斷和治療提

5、供新思路和新靶點(diǎn)。
　　目的:
　　1.研究TrkB基因多態(tài)與冠心病的相關(guān)性，探討TrkB是否冠心病的新的易感基因。
　　2.研究TrkB通路對(duì)血管內(nèi)皮通透性的影響，旨在發(fā)現(xiàn)TrkB在內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié)中的作用及分子機(jī)制。
　　3.闡明TrkB通路在炎性誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性中的保護(hù)作用，旨在發(fā)現(xiàn)保護(hù)內(nèi)皮防止內(nèi)皮損傷的新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.病例和對(duì)照收集不同地理區(qū)域的冠心病病例-對(duì)照志愿者2組。

6、>　　2.基因型分析全血基因組DNA的提取采用標(biāo)準(zhǔn)程序?；蛐蜋z測采用實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合Taqman探針技術(shù)。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因分析應(yīng)用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含TrkB啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，再經(jīng)定點(diǎn)誘變技術(shù)產(chǎn)生分別含-69C和-69G的pGL3-TrkB-69C和pGL3-TrkB-69G熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)后，多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶的熒光強(qiáng)度。
　　4.人和小鼠動(dòng)

7、脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TrkB表達(dá)收集動(dòng)脈粥樣硬化病人的主動(dòng)脈標(biāo)本。高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠8周制備AS模型。制備人及小鼠含動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主動(dòng)脈冷凍切片，使用TrkB抗體并采用常規(guī)免疫熒光技術(shù)檢測TrkB在主動(dòng)脈斑塊的表達(dá)定位。
　　5.9型腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建通過化學(xué)合成多對(duì)小干擾RNA，并將其導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞篩選出敲除效率最高的一對(duì)序列，并將其用于下調(diào)TrkB病毒的制備。采用常規(guī)基因克隆技術(shù)制備TrkB過表達(dá)質(zhì)粒，再采用定點(diǎn)誘變技術(shù)

8、對(duì)TrkB過表達(dá)載體的上述干擾RNA識(shí)別區(qū)進(jìn)行修飾，防止外源過表達(dá)TrkB被上述干擾RNA降解。將構(gòu)建好的上調(diào)及下調(diào)質(zhì)粒交深圳百恩威公司包裝9型腺相關(guān)病毒。
　　6.體內(nèi)內(nèi)皮通透性分析體內(nèi)內(nèi)皮屏障功能檢測采用伊文思藍(lán)分析。通過尾靜脈注射伊文思藍(lán)45分鐘再?zèng)_洗掉血管內(nèi)殘留的染料后，分離主動(dòng)脈并分析血管壁中滲漏的染料多少。
　　7.細(xì)胞培養(yǎng)
　　人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基; HeLa和293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM加

9、10％胎牛血清。所有細(xì)胞培養(yǎng)于37度含5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中。
　　8.體外旁細(xì)胞通透性分析采用transwell小室檢測FITC標(biāo)記的葡聚糖通過內(nèi)皮單層進(jìn)入下室的數(shù)量多少。待測標(biāo)本的熒光值檢測（激發(fā)波長485nm，吸收波長530nm）應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀。
　　9.跨內(nèi)皮遷徙檢測采用transwell小室計(jì)數(shù)T細(xì)胞跨過內(nèi)皮單層進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量多少，并計(jì)算遷徙細(xì)胞的百分比。
　　10.慢病毒載體構(gòu)建采用常規(guī)基因克隆技術(shù)分

10、別將大鼠TrkB基因和小鼠內(nèi)皮鈣粘蛋白基因的eDNA全長克隆到pCCL.PGK.TetLinker.WPRE慢病毒載體中。采用脂質(zhì)體2000的方法將該質(zhì)粒與ENV質(zhì)粒(VSV-G)，包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE)，andpRSV-REV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。
　　11.定量PCR定量PCR采用SYBR green染料方法用Light Cycler2.0(RocheDiagnostics，Mannheim，Ger

11、many)儀器檢測，相對(duì)定量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法。
　　12.WB分析總蛋白提取采用常規(guī)方法?？偟鞍捉?jīng)10％ SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，經(jīng)奶粉封閉后，分別用TrkB、內(nèi)皮鈣粘蛋白、tubulin等一抗孵育4度過夜，之后用HRP標(biāo)記的二抗孵育，化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行條帶的成像。
　　13.ChIP分析按照試劑盒說明書，從內(nèi)皮細(xì)胞中提取染色質(zhì)，然后用Ets1一抗進(jìn)行免疫沉淀。定量PCR檢測沉淀物中鈣粘蛋白啟動(dòng)

12、子的含量。
　　14.免疫熒光分析冷凍切片放入4％多聚甲醛中固定10分鐘。經(jīng)常規(guī)一抗、二抗和DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察。
　　15.統(tǒng)計(jì)分析所有統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS15.0軟件(SPSS，Chicago，IL)。
　　結(jié)果：
　　1.TrkB-69C＞G基因多態(tài)和冠心病相關(guān)。
　　我們?cè)趦蓚€(gè)獨(dú)立的不同地理區(qū)域人群中，比較了冠心病人與非冠心病人TrkB-69C＞G、IVS13+40G＞A兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因

13、型和基因頻率。結(jié)果表明:在兩組人群中TrkB-69C＞G基因多態(tài)的基因頻率和基因型頻率在冠心病及非冠心病人中均顯著不同(P＜0.05)。
　　多因素logistic回歸分析結(jié)果表明，在消除性別、年齡和體重指數(shù)等混淆因素的影響后， TrkB-69C純合子患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（山東組:OR值2.1，95％可信區(qū)間1.68-2.62;陜西組:OR值2.0，95％可信區(qū)間1.69-2.67)。
　　本研究中TrkB IVSI3+4

14、0G＞A多態(tài)位點(diǎn)未見于冠心病相關(guān)。
　　2.TrkB-69C純合子對(duì)應(yīng)降低的TrkB表達(dá)和升高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)。
　　我們檢測了含-69C或-69G的TrkB啟動(dòng)子對(duì)下游熒光素酶基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，無論-69C或-69G多態(tài)，TrkB啟動(dòng)子都能顯著啟動(dòng)下游熒光素酶的表達(dá)。
　　重要的是，在HeLa細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中-69C組的熒光素酶活性顯著低于-696組，說明-69C與-69G相比TrkB啟動(dòng)子的活性顯著降低。我

15、們的研究結(jié)果表明降低的TrkB表達(dá)可能和增加的冠心病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
　　3.TrkB表達(dá)于人及ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊的內(nèi)皮層免疫熒光檢測TrkB的表達(dá)，結(jié)果表明TrkB突出表達(dá)于野生型C57小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮層。
　　在ApoE敲基因小鼠早期斑塊中，TrkB也突出表達(dá)于早期斑塊的內(nèi)皮層。
　　在人主動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊中，TrkB突出表達(dá)在主動(dòng)脈內(nèi)皮。
　　4.TrkB防止ApoE敲基因鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮泄漏首先通

16、過尾靜脈注射9型腺相關(guān)病毒(AAV9)，我們觀察到AAV9-control攜帶的Zsgreen報(bào)告基因在小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮高效表達(dá)，表明病毒高效感染主動(dòng)脈內(nèi)皮。
　　隨后TrkB的敲除效率檢測表明AAV9-shTrkB導(dǎo)致小鼠主動(dòng)脈TrkB的表達(dá)降低93％，而AAV9-TrkB過表達(dá)病毒能外源恢復(fù)內(nèi)皮TrkB表達(dá)。
　　伊文思藍(lán)分析表明內(nèi)皮TrkB敲除導(dǎo)致ApoE敲基因鼠主動(dòng)脈伊文思藍(lán)沉積增加30％，而AAV9-TrkB過表達(dá)病

17、毒能防止這一變化。
　　內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果表明AAV9-shTrkB感染導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣粘蛋白的表達(dá)降低，而AAV9-TrkB過表達(dá)病毒能恢復(fù)鈣粘蛋白的表達(dá)。
　　5.內(nèi)皮鈣粘蛋白是介導(dǎo)TrkB的內(nèi)皮屏障保護(hù)作用的關(guān)鍵分子體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TrkB敲除能顯著增加FITC標(biāo)記的葡聚糖的跨內(nèi)皮擴(kuò)散、內(nèi)皮鈣粘蛋白空隙形成和T細(xì)胞跨內(nèi)皮遷徙。
　　內(nèi)皮TrkB敲除還導(dǎo)致鈣粘蛋白mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，而外源TrkB過

18、表達(dá)能防止鈣粘蛋白降低。
　　最重要的是TrkB敲除導(dǎo)致的增加的FITC-葡聚糖擴(kuò)散、鈣粘蛋白空隙增大和T細(xì)胞跨內(nèi)皮遷徙都能被過表達(dá)內(nèi)皮鈣粘蛋白阻止。
　　6.Ets1轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)TrkB活化誘導(dǎo)的鈣粘蛋白表達(dá)首先我們檢測了TrkB信號(hào)對(duì)Ets1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響。結(jié)果表明TrkB敲除導(dǎo)致顯著減少的Ets1表達(dá)，相反外源BDNF刺激引起的TrkB活化能夠誘導(dǎo)Ets1的表達(dá)增加。
　　接下來我們檢測了Ets1是否介導(dǎo)BD

19、NF誘導(dǎo)的內(nèi)皮鈣粘蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明Ets1 siRNA能有效阻斷BDNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮鈣粘蛋白的表達(dá)。
　　進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果表明BDNF不僅促進(jìn)Ets1的表達(dá)，而且促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位;而TrkB敲除導(dǎo)致降低的Ets1表達(dá)和核定位。
　　CHIP分析表明BDNF促進(jìn)Ets1與鈣粘蛋白啟動(dòng)子的結(jié)合活性。
　　7.TrkB活化能改善促動(dòng)脈粥樣硬化因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性我們進(jìn)一步研究了TrkB信號(hào)是否能保護(hù)內(nèi)皮屏障完整抵抗促動(dòng)脈

20、粥樣硬化因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性，結(jié)果表明TrkB活化能防止TNF-α誘導(dǎo)的FITC-葡聚糖跨內(nèi)皮擴(kuò)散、內(nèi)皮鈣粘蛋白空隙的形成、T細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷徙以及內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)減少。
　　而且TrkB在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性中的的保護(hù)作用能被Ets1小干擾RNA和內(nèi)皮鈣粘蛋白小干擾RNA阻斷。
　　結(jié)論：
　　1.TrkB-69C＞G基因多態(tài)和冠心病相關(guān)，TrkB-69C純合子對(duì)應(yīng)降低的TrkB表達(dá)和升高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)，提示T

21、rkB可能是冠心病新的易感基因，并在冠心病的發(fā)病過程中起保護(hù)作用。
　　2.TrkB突出表達(dá)在早期斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞中。
　　3.TrkB信號(hào)通過促進(jìn)Ets1介導(dǎo)的內(nèi)皮鈣粘蛋白合成保護(hù)內(nèi)皮完整。
　　4.TrkB活化能防止促炎因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性。
　　論文二、酪氨酸激酶受體B活化能防止ApoE-/-敲基因小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)育和內(nèi)皮鈣粘蛋白的裂解
　　背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosi

22、s，AS)是冠心病等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為大動(dòng)脈及中動(dòng)脈的血管內(nèi)壁出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，形成分散或成片的粥樣斑塊，造成動(dòng)脈管腔狹窄，隨后斑塊破裂出血，可在狹窄的動(dòng)脈內(nèi)形成血栓，可導(dǎo)致心梗、缺血性腦卒中發(fā)生。因此防止AS的發(fā)生發(fā)展，對(duì)防治心腦血管疾病有重要意義。內(nèi)皮功能異常是AS的始動(dòng)因素而且貫穿AS的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程。內(nèi)皮通透性增加，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)發(fā)生一系列反應(yīng)，如血漿內(nèi)的脂質(zhì)成分通過內(nèi)皮間隙進(jìn)入內(nèi)膜，單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜，進(jìn)

23、一步損傷血管和促進(jìn)AS斑塊的形成。
　　酪氨酸受體B是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的高親和力受體。BDNF-TrkB通路在中樞和外周神經(jīng)元的生存、生長和維持中發(fā)揮重要作用。但是除了在神經(jīng)系統(tǒng)中起作用以外，TrkB還在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用。有研究表明BDNF-TrkB通路能保護(hù)心肌防止缺血損傷。還有研究發(fā)現(xiàn)TrkB基因敲除小鼠表現(xiàn)為心肌內(nèi)血管明顯減少和出生后死亡;BDNF敲基因小鼠表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、心肌內(nèi)出血、降低的心臟收縮力和早期

24、出生后死亡;而BDNF-TrkB過表達(dá)則導(dǎo)致小鼠胚胎期心肌內(nèi)毛細(xì)血管的密度顯著增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)TrkB突出表達(dá)在血管內(nèi)皮并維持內(nèi)皮完整通過促進(jìn)內(nèi)皮鈣粘蛋白的表達(dá)。與我們的結(jié)果一致，Matsuda等也發(fā)現(xiàn)添加BDNF在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中能促進(jìn)內(nèi)皮鈣粘蛋白的表達(dá)。內(nèi)皮鈣粘蛋白在保護(hù)血管內(nèi)皮完整防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而內(nèi)皮TrkB信號(hào)對(duì)血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響尚無研究結(jié)果。本研究主要探討了AS形成過程中內(nèi)皮

25、損傷是否影響TrkB的表達(dá)，以及TrkB的表達(dá)改變是否影響AS斑塊的發(fā)展及其分子機(jī)制，旨在揭示內(nèi)皮TrkB在AS病理過程中的作用，為AS的防治提供新思路。
　　目的:
　　1.研究AS斑塊表面內(nèi)皮TrkB的表達(dá)是否發(fā)生變化。
　　2.研究抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮TrkB的表達(dá)對(duì)AS斑塊發(fā)展的影響。
　　3.研究TrkB對(duì)血管內(nèi)皮鈣粘蛋白裂解的影響及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.動(dòng)物研究程序ApoE-/-小

26、鼠通過尾靜脈注射不同的9型腺相關(guān)病毒顆粒并接受高脂喂養(yǎng)8周以誘導(dǎo)早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。之后取材并進(jìn)行后續(xù)分析。
　　2.油紅0染色主動(dòng)脈及主動(dòng)脈根的橫斷切片先用4％多聚甲醛固定， PBS浸洗后，用油紅O染色，然后顯微鏡下觀察并分析結(jié)果。
　　3.免疫熒光分析冷凍切片用4％多聚甲醛固定，PBS浸洗后，常規(guī)封閉、一抗、二抗孵育、及DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察分析結(jié)果。
　　4.WB分析
　　總蛋白提取，蛋白濃度檢測

27、，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后封閉，一抗二抗孵育，化學(xué)發(fā)光檢測及條帶的定量按本室常規(guī)方法。
　　5.定量PCR總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄采用常規(guī)方法。定量PCR采用SYBER GREEN染料方法。相對(duì)定量的計(jì)算方法采用2-ΔΔCt。
　　6.細(xì)胞培養(yǎng)
　　主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞用專門的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37度和5％二氧化碳。
　　7.統(tǒng)計(jì)分析
　　所有統(tǒng)計(jì)分析均應(yīng)用SPSS15.0軟件(SPSS，Chica

28、go，IL)。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面內(nèi)皮細(xì)胞的TrkB表達(dá)是降低的。
　　TrkB在斑塊表面內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)顯著下降，與野生型無動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮相比，TrkB在斑塊表面內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)降低35％。
　　TNF-α或氧化低密度脂蛋白刺激后，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TrkB的表達(dá)顯著降低。
　　2.在ApoE-/-小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中TrkB發(fā)揮保護(hù)血管抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用ApoE-/-小鼠

29、通過尾靜脈注射攜帶Zsgreen報(bào)告基因的對(duì)照AAV9病毒和攜帶TrkB干擾RNA的AAV9病毒并同時(shí)高脂喂養(yǎng)8周。注射病毒后，我們觀察到熒光報(bào)告基因Zsgreen在ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮層高效表達(dá)。
　　WB分析顯示TrkB敲除導(dǎo)致其在ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈的表達(dá)減少達(dá)到91％。
　　大體油紅O染色顯示TrkB敲除導(dǎo)致主動(dòng)脈斑塊面積顯著增加，與對(duì)照組相比斑塊面積增加達(dá)到40％。主動(dòng)脈根橫斷切片的油紅O染色也顯示

30、相似的結(jié)果。
　　3.TrkB敲除導(dǎo)致ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)增加的脂質(zhì)沉積、巨噬細(xì)胞浸潤和炎性反應(yīng)。
　　我們分析了主動(dòng)脈根切片中油紅O染色陽性面積占斑塊總面積的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TrkB敲除導(dǎo)致斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增加，與對(duì)照組相比脂質(zhì)含量增加35％。
　　免疫熒光染色顯示，TrkB敲除導(dǎo)致斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量也顯著上升，與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞的含量增加40％。
　　TrkB敲除導(dǎo)致斑塊內(nèi)促炎標(biāo)志物，包括

31、NF-κB，ICAM-1，VCAM-1，E-選擇素，TNF-α，和IL6的表達(dá)顯著上升。
　　4.BDNF能夠防止TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮鈣粘蛋白胞外域脫落通過增加內(nèi)皮鈣粘蛋白與VE-PTP的結(jié)合維持內(nèi)皮鈣粘蛋白的酪氨酸去磷酸化狀態(tài)。
　　TrkB敲除導(dǎo)致斑塊內(nèi)皮鈣粘蛋白的蛋白水平降低了79％，但是其mRNA水平卻僅降低43％。這個(gè)結(jié)果提示我們，TrkB敲除可能不僅涉及鈣粘蛋白的合成，還影響鈣粘蛋白的裂解。
　　我們研究了

32、BDNF-TrkB通路是否抑制鈣粘蛋白的胞外域脫落。我們發(fā)現(xiàn)BDNF預(yù)先孵育能顯著減少TNF-α誘導(dǎo)的鈣粘蛋白脫落片段的水平，而BDNF的這一作用可被TrkB干擾RNA阻止。
　　我們研究了BDNF對(duì)鈣粘蛋白酪氨酸磷酸化的影響。結(jié)果表明BDNF能顯著減少TNF-α誘導(dǎo)的鈣粘蛋白酪氨酸磷酸化，而且這一作用能被TrkB干擾RNA阻斷。
　　于是我們進(jìn)一步檢測了BDNF是否促進(jìn)VE-PTP與鈣粘蛋白的結(jié)合。結(jié)果表明用BDNF預(yù)先孵

33、育TNF-α刺激的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞能顯著增加與內(nèi)皮鈣粘蛋白免疫共沉淀的VE-PTP的水平。
　　在ApoE-/-小鼠中TrkB敲除導(dǎo)致主動(dòng)脈內(nèi)皮鈣粘蛋白酪氨酸磷酸化顯著增加，而與鈣粘蛋白免疫共沉淀的VE-PTP顯著減少。
　　結(jié)論：
　　1.TrkB是內(nèi)皮損傷反應(yīng)因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面內(nèi)皮TrkB的表達(dá)降低。
　　2.TrkB能保護(hù)內(nèi)皮防止早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展通過同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮鈣粘蛋白的合成和抑制鈣