Bruton酪氨酸激酶在嚴(yán)重?zé)齻∈蠹毙苑螕p傷發(fā)病中的作用和機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　 嚴(yán)重?zé)齻麜?huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化。創(chuàng)傷應(yīng)激、熱力直接損傷、組織低灌注等因素會(huì)引起單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等炎細(xì)胞活化，促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多；血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞受到強(qiáng)烈刺激后粘附分子表達(dá)及活化增強(qiáng)，而且隨著兩者粘附的加強(qiáng)，激活的白細(xì)胞出現(xiàn)呼吸爆炸、脫顆粒從而釋放出大量蛋白溶酶、活性氧、花生四烯酸等代謝產(chǎn)物及促炎細(xì)胞因子，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的廣泛損傷。上述病理生理過(guò)

2、程可概括為：嚴(yán)重?zé)齻?→促炎細(xì)胞因子表達(dá)增多-→白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell，EC)粘附激活、釋放大量炎癥介質(zhì)-→失控的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)。為了阻斷SIRS的發(fā)生和發(fā)展，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外提出了一些針對(duì)單個(gè)細(xì)胞因子的治療，例如細(xì)胞因子的單克隆抗體和可溶性受體等，但在臨床試用均無(wú)明顯效果，甚至還有增加死亡的報(bào)道。分析其原因，主要是細(xì)胞因

3、子及其代謝產(chǎn)物種類(lèi)眾多，構(gòu)成了一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，僅僅針對(duì)其中某一種或幾種進(jìn)行干預(yù)，往往達(dá)不到目的。但細(xì)胞因子作用于靶細(xì)胞時(shí)所必須經(jīng)過(guò)的受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則屈指可數(shù)，如果著重研究炎性介質(zhì)過(guò)度釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理，并對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，對(duì)于阻斷嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)失控性的全身炎癥反應(yīng)可能較之于針對(duì)某一單個(gè)炎癥介質(zhì)更為有效。
　　 Toll樣受體(Toll-1ikereceptors，TLRs)是一類(lèi)病原分子識(shí)別受體家族，它不僅能識(shí)別病原體

4、相關(guān)分子模式(PAMPs)，其某些成員，尤其是TLR4也可識(shí)別無(wú)菌性損傷后釋放的眾多內(nèi)源性分子即損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)。外源LPS或內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合后，活化MyD88和TRIF兩條信號(hào)途徑，前者活化NF-κB和MAPK信號(hào)通路，后者活化NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3信號(hào)通路。TLR4通過(guò)這些信號(hào)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、趨化因子等，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的炎癥和免疫反應(yīng)。近年來(lái)研究表明，TLR4及其信號(hào)通路介導(dǎo)的天

5、然免疫在感染和非感染性疾病引起的局部和全身炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)過(guò)程中具有重要作用。
　　 Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton’styrosinekinase，Btk)是胞漿非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，它是前B淋巴細(xì)胞發(fā)育所必需的。Btk的細(xì)胞表達(dá)譜較窄，僅限于髓系細(xì)胞，不表達(dá)于T淋巴細(xì)胞及組織漿細(xì)胞。Btk可增強(qiáng)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并最終激活NF-κB和MAPKs信號(hào)通路，繼而啟動(dòng)炎性基因表達(dá)。研究表明，Btk基

6、因突變或缺失的單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)LPS刺激不敏感，TNF-α、IL-1β和iNOS表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Btk對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用主要是通過(guò)NF-κB和p38激酶介導(dǎo)的。目前關(guān)于Btk信號(hào)通路與炎癥關(guān)系的研究仍多限于體外觀(guān)察，它在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用仍知之甚少。
　　 臨床觀(guān)察表明，肺臟是燒傷后功能不全發(fā)生率最高和發(fā)生時(shí)間最早的器官。肺臟不僅是氣體交換的器官，也是一些細(xì)胞因子和

7、激素產(chǎn)生和滅活的場(chǎng)所，加上肺臟本身在解剖學(xué)上相對(duì)較脆弱，易受到各種致病因素的打擊，因此肺臟是燒傷后炎性損害的主要靶器官之一。由于失控的炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，Btk作為眾多炎性介質(zhì)合成與釋放的重要上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能在A(yíng)LI的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此，本課題定位于肺組織，研究Btk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與嚴(yán)重?zé)齻缙谘装Y調(diào)控的關(guān)系以及其與燒傷后肺臟損傷的關(guān)系。
　　 二、研究目的
　　 1.觀(guān)察Btk信

8、號(hào)通路在嚴(yán)重?zé)齻∈蠓闻K中的表達(dá)及活化情況，初步探討B(tài)tk信號(hào)通路在嚴(yán)重?zé)齻蠹毙苑螕p傷發(fā)病及局部炎癥反應(yīng)中的作用。
　　 2.觀(guān)察抑制Btk活化后，嚴(yán)重?zé)齻∈蠓谓M織局部信號(hào)蛋白的動(dòng)態(tài)變化情況，探討B(tài)tk在燒傷誘導(dǎo)的小鼠肺組織中MAPK和NF-κB及相關(guān)通路參與炎性肺損傷發(fā)病機(jī)制的可能效應(yīng)。
　　 三、研究?jī)?nèi)容
　　 第一部分Btk激酶活化在燒傷后急性肺損傷發(fā)病中的作用
　　 健康成年的雄性C57BL/

9、6小鼠252只，隨機(jī)分為假燙對(duì)照組(C組)、燒傷組(S組)，燒傷+LFM-A13組(L組)。各組小鼠均予備皮、麻醉處置，S組、L組小鼠后軀干置98℃沸水中12s，復(fù)制30％TBSAⅢ°燙傷模型。L組在燒傷前1h及燒傷后6h，按4.2mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射LFM-A13，C、S組則予等量平衡液。按Parkland公式4ml/(kg*1％TBSA)計(jì)算總補(bǔ)液量，分別于傷后即刻、6h時(shí)相點(diǎn)分別腹腔注射總補(bǔ)液量50％的平衡液；C組不予燒傷及

10、補(bǔ)液。各組于傷后即刻、0.5h、1h、3h、6h和12h共6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，各取6只小鼠的肺臟以10％中性福爾馬林液固定待病理檢查；各組另取6只小鼠行下腔靜脈取血處死后取肺臟，1×PBS漂洗后液氮凍存。再于術(shù)后12h，各組另取6只小鼠行下腔靜脈取血處死后取肺臟，以濾紙吸干表面滲液及血跡后稱(chēng)重；再另各取6只小鼠從頸外靜脈注入1％伊文思藍(lán)，1小時(shí)后處死并灌洗肺循環(huán)，取左下肺待用。而后，全細(xì)胞裂解法提取各標(biāo)本總蛋白后，Westernblot法檢測(cè)各

11、組各時(shí)間點(diǎn)肺組織中Btk蛋白、磷酸化Btk蛋白、Caspase-3和Bcl-2活性含量；采用Carraway雙盲病理評(píng)分，評(píng)價(jià)各組小鼠肺損傷程度；免疫組織化學(xué)法對(duì)各組小鼠肺組織Btk蛋白進(jìn)行定位檢測(cè)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)各組小鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況；肺干濕重比測(cè)定各組小鼠肺組織含水量；伊文氏藍(lán)比色法檢測(cè)各組小鼠肺微血管通透性。
　　 第二部分Btk激酶在燒傷后肺內(nèi)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用

12、r>　　 采用第一部分?jǐn)⑹龅姆椒ㄖ谱鲃?dòng)物模型，在燒傷后12小時(shí)取材，處理標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-蛋白含量；Trizol法提取肺組織總mRNA后，RealtimePCR法分析TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOSmRNA表達(dá)水平；測(cè)定肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性。
　　 第三部分Btk激酶參與燒傷后肺炎性損傷的分子作用機(jī)制
　　 采用第一部分?jǐn)?/p>

13、述的方法制作動(dòng)物模型，在燒傷后即刻、0.5h、1h、3h、6h和12h共6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，各組小鼠行下腔靜脈抽凈血處死，分離肺臟，1×PBS漂洗表面血跡后，無(wú)菌濾紙吸干殘液，液氮冰凍條件下研磨成粉狀，分裝于Eppendorf管，置-80℃冰箱保存。以全細(xì)胞裂解法提取各標(biāo)本總蛋白，Westernblot法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)的肺組織中磷酸化p38、磷酸化JNK、磷酸化ERK、IκBα、磷酸化IκBα蛋白的含量，探討B(tài)tk參與燒傷后肺炎性損傷的分子作

14、用機(jī)理。
　　 四、研究結(jié)果
　　 第一部分
　　 燒傷組小鼠肺臟的病理評(píng)分在燒傷后6h至12h一直顯著高于假燙傷對(duì)照組，而燒傷+LFM-A13組小鼠肺臟的病理評(píng)分雖高于假燒傷對(duì)照組，但較燒傷組顯著降低。Westernblot結(jié)果示，假燙對(duì)照組小鼠肺臟僅有少量Btk蛋白表達(dá)，而燒傷后30minBtk蛋白即有顯著增加，隨后仍持續(xù)增加，在6h達(dá)到高峰，并持續(xù)到12h；Btk磷酸化蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與其總蛋白表達(dá)一致。預(yù)

15、先應(yīng)用LFM-A13后，燒傷后各時(shí)間點(diǎn)Btk磷酸化蛋白表達(dá)均較燒傷組顯著降低。免疫組化結(jié)果表明，Btk蛋白表達(dá)主要限于單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。
　　 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)及細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)顯示，假燙對(duì)照組基本未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；燒傷組則凋亡最為明顯；燒傷+LFM-A13組可見(jiàn)凋亡，但較燒傷組明顯減少。Westernblot結(jié)果提示，與假燙對(duì)照組比較，燒傷組小鼠肺組織內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白活化型Cas

16、pase-3、抗凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2表達(dá)均顯著增加；燒傷+LFM-A13組小鼠Caspase-3表達(dá)較燒傷組明顯下降，Bcl-2表達(dá)則較燒傷組更為顯著。
　　 肺干濕重比及伊文氏藍(lán)比色法顯示，燒傷后12h時(shí)相點(diǎn)，燒傷組肺組織含水量及微血管通透性均較假燙對(duì)照組顯著增高，燒傷+LFM-A13組肺組織含水量及微血管通透性亦顯著高于假燙對(duì)照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 第二部分
　　 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)

17、果示，燒傷后12h，燒傷組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-水平均顯著高于假燙對(duì)照組；燒傷+LFM-A13組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-水平辦顯著高于假燙對(duì)照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 燒傷組小鼠在燒傷后12h其肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOSmRNA的表達(dá)量始終顯著高于假燙對(duì)照組；而燒傷+LFM-A13組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和i

18、NOSmRNA的表達(dá)水平雖仍明顯高于假燙對(duì)照組水平，但卻顯著低于燒傷組。
　　 小鼠30％TBSAⅢ°燒傷后12小時(shí)，燒傷組小鼠肺組織的MPO活性顯著高于假燙對(duì)照組；燙傷+LFM-A13組MPO活性也顯著高于假燙對(duì)照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 第三部分
　　 Westernblot法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肺組織中磷酸化p38、磷酸化JNK、磷酸化ERK、IκBα、磷酸化IκBα的表達(dá)量并比較發(fā)現(xiàn)，在燒傷后30min，p

19、38和ERK即發(fā)生明顯活化，而JNK在燒傷后3h才開(kāi)始明顯活化；NF-KB在燒傷30min后即發(fā)生明顯活化，但其活化隨時(shí)間點(diǎn)推移逐漸減弱。而使用LFM-A13預(yù)干預(yù)后再給予燒傷刺激，與單純燒傷組比較發(fā)現(xiàn)，抑制Btk活化可顯著抑制燒傷后早期p38和NF-κB活化，但不影響JNK和ERK活化。
　　 五、研究結(jié)論
　　 (1)Btk特異性抑制劑可明顯抑制燒傷小鼠肺組織Btk活化，減輕Btk蛋白在單核/巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎