Tec酪氨酸激酶作用蛋白RAI16的初步研究.pdf

1、蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中。生物學中的許多現(xiàn)象如細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)及GST沉淀(GSTpull-down)技術(shù)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。 Tec(

2、tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)是一種存在于胞質(zhì)內(nèi)的非受體型蛋白酪氨酸激酶，最初于肝癌組織中篩選得到，它參與多種細胞因子的信號傳遞過程，是多種細胞因子、輔助分子及受體型PTK信號轉(zhuǎn)導過程中一個重要的靶分子。一方面，Tec能夠?qū)κ荏w型蛋白酪氨酸激酶(包括生長因子受體、細胞因子受體、G蛋白耦聯(lián)受體、抗原受體)及整合素等傳導的各種胞外刺激做出反應(yīng)[1,2]。同時，Tec可以被許

3、多非受體型蛋白酪氨酸激酶調(diào)節(jié)，如：Src、JAK、Syk和FAK家族激酶等。Tec還可以調(diào)節(jié)多種主要信號傳導路徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)通路、磷脂酶C(PLCr)[3-5]通路以及蛋白激酶C(PKC)通路[6]。研究表明，Tec是造血細胞和免疫細胞活化、發(fā)育、增值和成熟信號轉(zhuǎn)導途徑中關(guān)鍵的蛋白激酶連接分子，而Tec的激酶結(jié)構(gòu)域是其特征性結(jié)構(gòu)之一，通過對這一結(jié)構(gòu)域及其相互作用蛋白分子的研究，將為我們深入地了解Tec的功能，闡

4、明其在細胞擴增及誘導分化信號轉(zhuǎn)導途徑中的位置和作用提供重要的線索。 我們前期工作以Tec激酶結(jié)構(gòu)域作為“釣餌”蛋白，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選構(gòu)建于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)載體的cDNA文庫，經(jīng)營養(yǎng)缺陷選擇及誘導篩選，發(fā)現(xiàn)并確證了一個新的陽性克隆。本研究對篩庫所得基因片段測序并經(jīng)BLAST比對分析后，確定為RAI16(Homosapiensretinoicacidinduced16)基因，已被GeneBank收錄(編號為BC05223

5、7)，組織來源為腦Ⅳ型星狀細胞瘤，其編碼蛋白為人視黃酸誘導蛋白16。隨后以RAI16蛋白為切入點，一方面利用相關(guān)的生物信息學站點及計算機軟件，對RAI16進行生物信息學分析，從中獲得其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的重要信息，從而根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測其功能；另一方面將RAI16基因構(gòu)建于原核表達載體中，進行融合表達，并進一步純化融合蛋白，為下一步RAI16功能研究奠定重要基礎(chǔ)。 主要工作內(nèi)容包括： 1.RAI16蛋白生物信息學分析。

6、 生物信息學分析結(jié)果提示：編碼蛋白質(zhì)全長759aa，分子量為83.8kD。該蛋白有很長的酪氨酸尾部，并有一段9aa長的過氧化物酶前導信號2(SKL2)(KLLLVRKQLat698)。蛋白質(zhì)同源性分析未見有意義的同源蛋白。 RAI16蛋白含有6個可能的PKC磷酸化位點，9個可能的CK2位點，3個Tyr磷酸化位點，6個N-豆蔻?；稽c，2個酰胺化位點，3個酪氨酸硫酸化位點以及1個ATP-GTP結(jié)合位點。 RAI16蛋白等電

7、點為5.31，體外半衰期為5.5h，氨基酸組成成分中，亮氨酸含量最高，N端序列考慮為亮氨酸。蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)為53.11(Ⅱ級)，該蛋白分類為不穩(wěn)定性蛋白。蛋白脂質(zhì)系數(shù)為94.23。GRAVY值為-0.136，為親水蛋白。 成熟的RAI16蛋白可以形成α-螺旋、β-折疊及環(huán)狀結(jié)構(gòu)(LOOP)等多種二級結(jié)構(gòu)形式，其中大多為α-螺旋，該蛋白質(zhì)為一包裹緊密的球狀蛋白。此外，該蛋白無跨膜區(qū)，具有一段由31個氨基酸組成的信號肽，且其切割位

8、點位于30～31aa之間，推測為一種分泌蛋白。其亞細胞定位位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。具有如下幾個半胱氨酸結(jié)合區(qū)(95～109、176～236、202～220、269～305、306～365)以及多個蛋白酶切位點。 2.GST-RAI16融合蛋白原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建。 巢式PCR法擴增目的片段，將其構(gòu)建到含有GST標記的原核表達載體pGEX4T-2質(zhì)粒中，與GST基因構(gòu)成融合基因，并保持靶基因的閱讀框不變。PCR及酶切鑒定正確，DNA測

9、序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中RAI16堿基序列和閱讀框均正確，重組質(zhì)粒成功，命名為pGEX4T-2/RAI16。 3.GST-RAI16融合蛋白的原核表達及純化。 將重組質(zhì)粒pGEX4T-2/RAI16轉(zhuǎn)化入蛋白酶缺陷的大腸桿菌BL-21中，在低溫下(30℃)IPTG(0.4mM)誘導4hr，以超聲細胞破碎儀裂解細菌，取誘導前細菌總蛋白、誘導后培養(yǎng)液上清及誘導后沉淀，經(jīng)10％SDS-PAGE檢測蛋白表達，觀察融合蛋白表達部位與

10、形式，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式表達，分子量約為75kDa，再依此條件大量誘導表達，將包涵體進行尿素法變性復(fù)性處理后，得到可溶的融合蛋白，另外將以可溶形式存在于上清中的表達產(chǎn)物直接過親和層析柱，獲得了可溶的高純度GST-RAI16融合蛋白。 Tec(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)最早是從肝癌組織中篩選出的一種重要的非受體型蛋白酪氨酸激酶，它存在于胞質(zhì)內(nèi)，主要在