非受體酪氨酸激酶c-Abl調(diào)節(jié)微管組裝的機(jī)理研究.pdf

1、非受體型酪氨酸激酶c-Abl是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的同源基因，在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)。C-Abl蛋白具有豐富的結(jié)構(gòu)域，其中SH3結(jié)構(gòu)域能特異地識(shí)別富含脯氨酸殘基的蛋白區(qū)域，SH2結(jié)構(gòu)域能特異地識(shí)別可被磷酸化的酪氨酸序列。通過(guò)NLS和NES結(jié)構(gòu)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間進(jìn)行穿梭，使之定位于不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)胞質(zhì)c-Abl通過(guò)其C端與G/F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，從而調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞骨架的變

2、化。C-Abl在正常生理及病理?xiàng)l件下具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附遷移和細(xì)胞凋亡調(diào)控，并在氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
　　 微管是一種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，主要由微管蛋白α/β二聚體組成，具有支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、固定細(xì)胞器位置的作用，并參與構(gòu)成纖毛與鞭毛、神經(jīng)細(xì)胞軸突，另外還是中心體和紡錘體的重要組成部分。紡錘體在有絲分裂過(guò)程發(fā)揮著極其重要的作用，在有絲分裂期牽引染色體的移動(dòng)并介導(dǎo)姐妹染色體的分離，在有絲分

3、裂末期引導(dǎo)收縮環(huán)的形成從而促進(jìn)胞質(zhì)分裂。
　　 PLK1和FOXM1是兩個(gè)與細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白，它們都呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴性表達(dá)。FOXM1是一類(lèi)DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬FOX蛋白家族，主要參與細(xì)胞周期特異性基因的調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，它的表達(dá)和活性受許多增殖信號(hào)和抗增殖信號(hào)的調(diào)節(jié)。PLK1屬于Polo樣激酶家族，是一類(lèi)廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生等方面有重要作用。它們

4、都參與中心體和紡錘體的形成。FOXM1是PLK1激酶的底物，F(xiàn)OXM1也可以調(diào)節(jié)PLK1的表達(dá)，二者通過(guò)相互作用調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞周期蛋白和因子，共同影響細(xì)胞周期。
　　 本研究通過(guò)免疫沉淀和免疫印跡證實(shí)，c-Abl可以與PLK1相互作用，并磷酸化PLK1，因此PLK1是c-Abl激酶的底物。還通過(guò)細(xì)胞周期同步化的方法發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用以及c-Abl對(duì)PLK1的磷酸化都是隨細(xì)胞周期進(jìn)程的變化而變化的。還通過(guò)熒光定量PCR和報(bào)告基

5、因檢測(cè)技術(shù)證實(shí)c-Abl可以促進(jìn)FOXM1的轉(zhuǎn)錄；通過(guò)脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Abl可以抑制FOXM1的降解；通過(guò)免疫印跡的方法證明c-Abl可提高FOXM1的蛋白水平，且這種作用依賴于c-Abl的激酶活性。因此c-Abl激酶通過(guò)與其底物PLK1相互作用并調(diào)節(jié)其磷酸化而間接影響了FOXM1的表達(dá)和蛋白穩(wěn)定性。
　　 本研究中分離了聚合和溶解狀態(tài)的微管蛋白，通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)了它們的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后溶解狀態(tài)的微管所占

6、比例升高，而聚合狀態(tài)所占微管的比例下降；又通過(guò)非變性PAGE膠分離了生理狀態(tài)的微管，發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后微管的聚合程度明顯下降，這說(shuō)明c-Abl能夠抑制微管的解聚。還通過(guò)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)變得模糊和彌散，說(shuō)明c-Abl缺陷影響了微管的組裝。另外我們還用免疫印跡的方法比較了c-Abl敲低細(xì)胞中微管蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比，c-Abl敲低后微管蛋白的量明顯下降，這說(shuō)明c-Abl可抑制微管蛋白的降解。

7、>　　 C-Abl對(duì)微管聚合和組裝的影響勢(shì)必影響紡錘體的組裝。我們通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)有絲分裂期紡錘體進(jìn)行了免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后紡錘體的組裝出現(xiàn)缺陷。還發(fā)現(xiàn)非分裂期的c-Abl敲低細(xì)胞系中有許多多核細(xì)胞出現(xiàn)，這說(shuō)明c-Abl缺陷影響了胞質(zhì)分裂的正常進(jìn)行。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的c-Abl底物PLK1，并初步證實(shí)c-Abl通過(guò)與PLK1相互作用和對(duì)PLK1進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而通過(guò)多個(gè)途徑對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)。C-Abl