重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子對(duì)人多藥耐藥SK0V3-DDP細(xì)胞的體外作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌患者對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性是影響療效的主要原因之一。傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)劑因副作用大而使得臨床應(yīng)用受到限制，因此尋找高效、低毒的逆轉(zhuǎn)劑是目前研究方向及熱點(diǎn)之一。重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factor,rmh-TNF)是由國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然TNF的結(jié)構(gòu)而研制出的一種高效、低毒的TNF突變體。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察rmh-TNF對(duì)人卵巢癌多藥耐藥細(xì)胞系

2、SKOV3/DDP耐藥性的影響，并對(duì)可能存在的機(jī)制進(jìn)行初步的探討，以期尋找一種新的藥物幫助解決卵巢癌治療中出現(xiàn)的多藥耐藥問(wèn)題。 方法：體外培養(yǎng)人卵巢癌多藥耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP，采用四氮唑噻藍(lán)鹽(MTT)比色法檢測(cè)rmh-TNF對(duì)SKOV3/DDP耐藥株的細(xì)胞毒作用，選擇殺傷率<10％的濃度作為該藥物的無(wú)毒劑量，即本實(shí)驗(yàn)的逆轉(zhuǎn)劑量。同法測(cè)定逆轉(zhuǎn)劑量的rmh-TNF干預(yù)后細(xì)胞株SKOV3/DDP對(duì)順鉑耐藥性的變化；應(yīng)用流式細(xì)

3、胞術(shù)(FCM)檢測(cè)rmh-TNF干預(yù)不同時(shí)間段SKOV3/DDP細(xì)胞株中GST-π蛋白、BCL-2蛋白的表達(dá)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析rmh-TNF處理SKOV3/DDP細(xì)胞前后mdrl mRNA、BCL-2 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、MTT結(jié)果顯示：rmh-TNF在(50-3200)U/ml以內(nèi)能抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的體外增殖，且隨著濃度增加抑制率相應(yīng)上升。回歸分析得出當(dāng)rmh-TNF終濃度

4、<122.34U/ml，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用(細(xì)胞存活率均>90％)因此本實(shí)驗(yàn)選用100U/ml作為逆轉(zhuǎn)劑量。100U/mlrmh-TNF作用SKOV3/DDP 24、48、72h的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.19倍、2.20倍、2.64倍。 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩組細(xì)胞GST-π蛋白表達(dá)量的相對(duì)值(FI)分別是1、2.33±0.30，兩株細(xì)胞GST-π蛋白的表達(dá)具有極顯著性差

5、異(P<0.01)，100U/mlrmh-TNF作用細(xì)胞SKOV3/DDP 24、48、72h后GST-π蛋白表達(dá)量的相對(duì)值隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，F(xiàn)I值分別為1.82±0.13、1.73±0.28、1.31±0.17，作用前后比較均有顯著性差異(P<0.05)；rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩株細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)量的相對(duì)值(FI)分別是1、2.62±0.15，兩株細(xì)胞BCL-2蛋白的表達(dá)具有極顯著性差異(P

6、<0.01)，100U/ml rmh-TNF作用細(xì)胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2蛋白表達(dá)量的相對(duì)值隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，F(xiàn)I值分別為2.24±0.20、1.71±0.19、1.30±0.15，作用前后比較均有顯著性差異(P<0.05)。 3、RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示rmh-TNF處理前SKOV3細(xì)胞株不表達(dá)mdrl mRNA，SKOV3/DDP細(xì)胞株mdrl mRNA表達(dá)量的相對(duì)值(mdrl/β-a

7、ctin)是0.76±0.01。100U/ml rmh-TNF作用細(xì)胞株SKOV3/DDP 24、48、72，mdrl mRNA表達(dá)量的相對(duì)值隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，mdrl/β-actin值分別為0.66±0.05、0.52±0.04、0.45±0.03，作用前后差異均有顯著性。(P<0.05)；rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩株細(xì)胞BCL-2 mRNA表達(dá)量的相對(duì)值(BCL-2/β-actin)分別是0.09

8、±0.15、0.47±0.01，兩株細(xì)胞BCL-2 mRNA的表達(dá)具有極顯著性差異(P<0.01)，100U/ml rmh-TNF作用細(xì)胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2 mRNA表達(dá)量的相對(duì)值隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，BCL-2/β-actin值分別為0.45±0.01、0.31±0.01、0.27±0.01，作用前后比較均有極顯著性差異(P<0.01) 結(jié)論： 1、重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmh-

9、TNF)在(50-3200)U/ml濃度范圍內(nèi)，對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，且呈濃度依賴性。 2、逆轉(zhuǎn)劑量的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmh-TNF)對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞耐順鉑效應(yīng)有一定的逆轉(zhuǎn)作用，且逆轉(zhuǎn)效應(yīng)存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 3、逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能為：①逆轉(zhuǎn)劑量的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmh-TNF)可能通過(guò)下調(diào)耐藥相關(guān)基因mdrl mRNA表達(dá)，進(jìn)而降低SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)耐藥。②逆轉(zhuǎn)劑