注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子治療人胃癌主要藥效學(xué)及作用機(jī)制.pdf

1、目的：注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(RecombinantMutant Human Tumor Necrosis Factor for injection，rmh-TNF NC)，是用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，以原型腫瘤壞死因子的cDNA為模版，改造TNF基因，由151個(gè)氨基酸組成的非糖基化多肽單鏈，分子量為16598道爾頓。這一改構(gòu)擴(kuò)大了TNF-α的療效范圍，增強(qiáng)了其抗腫瘤的活性，提高了TNF-α結(jié)合的效率，獲得了高活性、低毒性的

2、新型重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子，簡稱rmh-TNF。rmh-TNF屬于天然TNF-α的改構(gòu)體，具有與天然TNF相似的生物學(xué)活性，它不僅有效殺傷多種腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)正常細(xì)胞(受體選擇性)無細(xì)胞毒作用，且具有較明顯的化療增敏作用。rmh-TNF是新近進(jìn)入臨床的國家一類新藥，主要臨床適應(yīng)癥是晚期非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金氏淋巴瘤，尚未見對(duì)于消化道腫瘤尤其是胃癌的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。目前胃癌仍然是世界第二位癌癥死亡原因和第四位高發(fā)的癌癥，每年約有650000

3、死亡病例和880000新增病例，幾乎有2/3是發(fā)生在發(fā)展中國家。本研究目的是通過檢測(cè)人胃癌細(xì)胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12增殖和凋亡情況，及血管形成能力、克隆形成能力和遷移能力的變化，及對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤模型的治療作用，研究rmh-TNF治療人胃癌方面主要藥效學(xué)，并通過蛋白印跡法和免疫共沉淀初步探究其作用機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12，分別用不同濃度rm

4、h-TNF和TNF-α處理，并設(shè)對(duì)照組。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，Annexin V-FITC/PI和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的周期分布和凋亡率。小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVWEC-12血管生成能力的變化。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及劃痕法檢測(cè)BGC-823克隆形成能力和遷移能力的變化。建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，分為rmh-TNF、TNF-α及陽性對(duì)照(5-Fu)和陰性對(duì)照(生理鹽水)組進(jìn)行治療性實(shí)驗(yàn)，繪制移植瘤生長曲線，計(jì)

5、算瘤質(zhì)量抑制率，觀察其對(duì)皮下成瘤能力的影響，觀察生存時(shí)間和生命延長率，一般情況及解剖學(xué)變化，HE染色觀察腫瘤組織病理改變，CD34免疫組化檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中Procaspase-3，Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。免疫共沉淀檢測(cè)rmh-TNF與DR5間是否有相互作用。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示rmh-TNF能抑制BGC-823細(xì)胞和HUVEC-12細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)良好的時(shí)效關(guān)系

6、和量效關(guān)系，其IC50值約為TNF-α的1/2-3/4，差異有顯著性(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明rmh-TNF有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，呈劑量依賴性。rmh-TNF和TNF-α處理后兩種細(xì)胞周期分析均出現(xiàn)S期細(xì)胞增多而G0/G1期和G2/M期細(xì)胞減少，凋亡率增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。小管形成實(shí)驗(yàn)顯示rmh-TNF對(duì)血管形成有抑制作用，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和劃痕法證實(shí)rmh-TNF對(duì)BGC-823

7、細(xì)胞的克隆形成及遷移能力有抑制作用。皮下移植瘤模型構(gòu)建成功，腫瘤生長曲線顯示rmh-TNF組瘤體生長明顯受到抑制，rmh-TNF組瘤質(zhì)量抑制率為83.13％。rmh-TNF組，TNF-α組和陽性對(duì)照組生命延長率分別為85.18％，62.34％，及59.88％，陰性對(duì)照組荷瘤裸鼠一般情況明顯較治療組和陽性對(duì)照組差，各組裸鼠解剖學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)除移植瘤以外的其它器官、系統(tǒng)病變。HE染色病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組腫瘤組織有明顯的凋亡和

8、壞死形成，癌細(xì)胞的異型性明顯減小，CD34免疫組化顯示MVD明顯減小，其中rmh-TNF組較其他各組減小更為明顯(P<0.05)。蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)BGC-823細(xì)胞中rmh-TNF組較對(duì)照組中Procaspase-3和Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，且有劑量依賴性。免疫共沉淀證實(shí)rmh-TNF和DR5間存在相互作用。
　　 結(jié)論：1.rmh-TNF對(duì)于體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC

9、-12具有抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；2.rmh-TNF能抑制HUVEC-12的血管生成能力和BGC-823的克隆形成能力，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)，對(duì)BGC-823的遷移能力有抑制作用；3.人胃癌細(xì)胞BGC-823在BALB/c-裸鼠皮下有良好的成瘤性；4.rmh-TNF對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型有治療作用，能抑制皮下移植瘤生長

10、，延長荷瘤裸鼠生存時(shí)間，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；5.rmh-TNF能夠?qū)е氯宋赴┘?xì)胞BGC-823BALB/c裸鼠皮下移植瘤出現(xiàn)凋亡和壞死，并對(duì)移植瘤中的血管生成有抑制作用，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；6.rmh-TNF可能通過使Procaspase-3表達(dá)上調(diào)并裂解激活，并使Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2值上升，從而發(fā)揮其促凋亡作用；7.rmh-TNF可能通過