重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子協(xié)同順鉑對(duì)小鼠Lewis肺癌抑制作用及機(jī)理的研究.pdf

1、目的：肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，盡管臨床上規(guī)范化治療的實(shí)施，但肺癌患者的5年生存率仍不足20％，如何增強(qiáng)現(xiàn)有的抗腫瘤藥物的抗瘤作用，提高化療療效，是目前發(fā)展抗腫瘤藥物應(yīng)用的研究方向之一。本研究擬通過Lewis肺癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用生理鹽水、順鉑(cisplatin,DDP)、重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(recombinantmutant human tumor necrosis factor,rmhTNF)及兩藥聯(lián)合進(jìn)行干預(yù)，測量各

2、組動(dòng)物的平均瘤重，計(jì)算抑瘤率，測定腫瘤細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期以及Lewis肺癌組織內(nèi)凋亡抑制因子(Survivin)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)水平，從而闡明重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌有協(xié)同抑制作用，并初步探討其可能發(fā)生作用的機(jī)制。 方法： 1、建立模型和實(shí)驗(yàn)分組：將40只體重為19-21克健康雄性C57BL/6小鼠稱重，隨機(jī)分為4組(每組10只)：生理鹽水組(對(duì)照組)、DDP組(6.15mg/kg)、rmh

3、TNF組(150萬U/kg)以及rmhTNF(150萬U/kg)與DDP(6.15mg/kg)聯(lián)合組。將小鼠Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞株接種于各組小鼠右上肢腋窩皮下，構(gòu)建Lewis肺癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2、抑瘤作用評(píng)價(jià)：接種后隔日檢查皮下腫瘤生長情況。接種第7天，都可捫及腫瘤，待第12天，捫及皮下腫瘤平均大小約(1.0×1.0×1.0)cm3時(shí)開始按分組分別給予瘤內(nèi)注射生理鹽水、DDP、rmhTNF、rmhTNF+DDP，每只0

4、.2mL，連續(xù)三天，停藥24小時(shí)后脫頸椎處死全部小鼠，立即剝離皮下腫瘤，稱取瘤重，計(jì)算各組平均瘤重及抑瘤率。 3、流式細(xì)胞術(shù)測定Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。 4、免疫組化學(xué)法檢測Lewis肺癌移植瘤組織內(nèi)Survivin、PCNA表達(dá)水平，比較各組之間的差異。 5、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Survivin的表達(dá)，比較各組之間的差異。 6、統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟

5、件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)的形式表示。兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性，P>0.05為差異無顯著性。 結(jié)果： 1、平均瘤重及抑瘤率：DDP組和rmhTNF組小鼠的平均瘤重分別為2.964±0.091g、3.010±0.089g較對(duì)照組的瘤重3.576±0.126g減輕(P<

6、0.05)，但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組小鼠的平均瘤重為2.267±0.050g與對(duì)照組相比減輕尤為明顯(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的平均瘤重低于DDP組和rmhTNF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從抑瘤率來看，與對(duì)照組相比，DDP組、rmhTYNF組及rmhTNF+DDP組對(duì)小鼠移植瘤均有明顯的抑制作用，DDF組、rmhTNF組及rmhTNF+DDP組的抑瘤率分別為17.115

7、％、15.828％，36.605％。其中以聯(lián)合用藥組的抑瘤率最為顯著。聯(lián)合用藥的q值等于1.2，表明兩藥具有協(xié)同作用，rmhTNF具有增強(qiáng)DDP抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生長的作用。 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：與對(duì)照組相比，DDP組和rmhTNF組細(xì)胞G0/G1期比例增加，S期比例下降，增殖指數(shù)PI下降(P<0.05)；rmhTNF+DDP組測得細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加、S期比例明顯下降，增殖指數(shù)PI明顯下降(P<0.01)

8、。而且rmhTNF+DDP組與DDP組和rmhTNF組相比G0/G1期比例增加、S期比例下降，增殖指數(shù)PI下降(P<0.05)。瘤組織經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率結(jié)果顯示：DDP組、rmhTNF組和rmhTNF+DDP組均測得典型的亞二倍體凋亡峰，rmhTNF組、DDP組的凋亡率分別為：20.269％、21.599％，與對(duì)照組16.103％比較凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhT

9、NF+DDP組腫瘤組織中癌細(xì)胞的凋亡率為28.175％較對(duì)照組升高更為明顯，有顯著性差異(P<0.01)，而rmhTNF+DDP組凋亡率高于DDP組和rmhTNF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3、免疫組化檢測結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示：rmhTNF組和DDP組腫瘤組織中PCNA陽性標(biāo)記指數(shù)(Labeling index，LI)平均值分別為(40.875±3.271)％、(40.500±4.567)％均低于對(duì)照組(61.37

10、5±6.759)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組腫瘤組織中PCNA LI為(29.125±3.833)％與對(duì)照組相比降低尤為明顯(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的PCNA LI低于DDP組和rmhTNF組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rmhTNF組和DDP組腫瘤組織中Survivin LI平均值分別為(31.000±2.507)％、(30.375±2

11、.875)％低于對(duì)照組(43.750±4.166)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組腫瘤組織中Survivin LI為(22.375±4.138)％與對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的Survivin LI低于DDP組和rmhTNF組(P<0.05)。 4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Survivin的表達(dá)結(jié)果：r

12、mhTNF組和DDP組的SurvivinmRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組下降(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組的小鼠腫瘤組織中Survivin mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，較對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而rmhTNF+DDP組的Survivin mRNA表達(dá)與rmhTNF組和DDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1、本研究選用與人類肺癌極為相似的理想

13、動(dòng)物模型，對(duì)肺癌的進(jìn)一步研究有著重要意義。 2、重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，具有協(xié)同抗腫瘤的作用，可明顯抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長，改變細(xì)胞周期的分布，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 3、DDP組、rmhTNF組及rmhTNF+DDP組均可下調(diào)小鼠Lewis肺癌移植瘤Survivin和PCNA蛋白表達(dá)水平，但rmhTNF+DDP組對(duì)Survivin和PCNA蛋白

14、表達(dá)的影響更為顯著。 4、rmhTNF+DDP組對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長有明顯抑制作用，并顯著下調(diào)小鼠Lewis肺癌移植瘤的Survivin和PCNA蛋白表達(dá)水平。據(jù)此可推測，其發(fā)生的可能機(jī)制是：一是聯(lián)合組可通過抑制PCNA蛋白的表達(dá)，減低DNA聚合酶的活性，干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。一是聯(lián)合組通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin基因的表達(dá)水平，使Caspase介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活，達(dá)到促凋亡