人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶人腫瘤壞死因子a基因逆轉(zhuǎn)絨癌耐藥的體外研究.pdf

1、目的：對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是絨癌治療失敗的主要原因之一。人腫瘤壞死因子(huTNF-a)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)的確能在mRNA水平和蛋白水平逆轉(zhuǎn)絨癌耐藥細(xì)胞株的多藥耐藥基因(MDR1)，增加絨癌耐藥細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的敏感性。全身應(yīng)用TNF-a能引起嚴(yán)重的副反應(yīng)，而且外源性TNF-a通過(guò)層層障礙到達(dá)腫瘤細(xì)胞后，真正與腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用的很少。尋找理想的轉(zhuǎn)基因的載體，將TNF-a帶到腫瘤局部發(fā)揮作用，成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具備成為

2、轉(zhuǎn)基因載體的很多優(yōu)勢(shì)，例如：分布廣泛，易于獲得，有很強(qiáng)的復(fù)制、擴(kuò)增能力，更重要的是具有腫瘤趨化特性。本研究通過(guò)腺病毒介導(dǎo)huTNF-a基因轉(zhuǎn)染人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(huUCB-MSCs)，與絨癌耐藥細(xì)胞株共培養(yǎng)后，觀察耐藥細(xì)胞株耐藥指數(shù)的變化及huUCB-MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向趨化能力。 方法：利用人的臍帶血分離、培養(yǎng)、純化獲得huUCB-MSCs，并鑒定之。構(gòu)建攜帶huTNF-a基因的腺病毒載體Ad5-TNFa-IRES-EG

3、FP，用之感染體外培養(yǎng)的huUCB-MSCs，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中TNF-a濃度，采用細(xì)胞病變結(jié)晶紫染色法測(cè)定上清液中TNF-a的活性；用免疫印跡方法(Western Blot)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)huTNF-a基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。采用間歇誘導(dǎo)的方法成功建立絨癌耐藥細(xì)胞株JEG-3/VP16并鑒定它的耐藥性。將JEG3-VP16和攜帶huTNF-a基因的huUCB-MSC

4、s共培養(yǎng)，MTT法測(cè)定共培養(yǎng)后JEG3-VP16耐藥指數(shù)。應(yīng)用穿孔試驗(yàn)法研究攜帶huTNF-a基因的huUCB-MSCs對(duì)JEG3-VP16的定向趨化及遷移能力。 結(jié)果：來(lái)源于人臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后出現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞形態(tài)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。該細(xì)胞表達(dá)MSCs的相關(guān)抗原CD29、CD44、CD90，但不表達(dá)造血干細(xì)胞的相關(guān)抗原CD34、CD45，這與源于骨髓的MSCs一致。對(duì)體外培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行成骨和成脂肪

5、誘導(dǎo)后，多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出成骨和成脂肪的能力。采用AdMax包裝系統(tǒng)制備出以綠色熒光蛋白(EGFP)作為報(bào)告基因的腺病毒載體Ad5-TNFa-IRES-EGFP。測(cè)定病毒滴度為5.2×108PFU/ml。熒光顯微鏡觀察到攜帶huTNF-a基因的腺病毒高效率感染huUCB-MSCs。RT-PCR檢測(cè)到huUCB-MSCs中huTNFa的mRNA的表達(dá)，Western Blot沒(méi)有檢測(cè)到TNFa蛋白表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后16h-48h內(nèi)

6、huUCB-MSCs上清液中的huTNFa濃度呈漸進(jìn)上升的趨勢(shì)，并可持續(xù)分泌到轉(zhuǎn)染后10天。結(jié)晶紫染色法提示轉(zhuǎn)染后上清液中TNFa有活性。成功誘導(dǎo)絨癌耐藥細(xì)胞株JEG3-VP16并用MTT法鑒定其耐藥性。JEG-3/VP16和轉(zhuǎn)染huTNFa基因的huUCB-MSCs共培養(yǎng)后，MTT法測(cè)定jeg-3/vp16對(duì)VP16、5FU、MTX的IC50分別下降了12.8，6.75和10.1倍；而與未感染huTNFa的huUCB-MSCs共培養(yǎng)的

7、jeg-3/vp16的IC50只分別下降了1.08，1.22和1.05倍。說(shuō)明攜帶TNFa基因的huUCB-MSCs能逆轉(zhuǎn)jeg-3/vp16的耐藥性。穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JEG-3/VP16組的光密度值(0.39±0.03)顯著高于空白對(duì)照組(0.11±0.08)及成纖維細(xì)胞組(0.10±0.05)，說(shuō)明JEG-3/VP16組定向遷移的huUCB-MSCs數(shù)量明顯多于成纖維細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組，即huUCB-MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞有定向趨化

8、遷移的能力。 結(jié)論：人臍血中含有豐富的MSCs足夠滿足體外實(shí)驗(yàn)需要。MSCs具有轉(zhuǎn)基因載體的諸多優(yōu)勢(shì)，在本實(shí)驗(yàn)中成功扮演了huTNFa基因載體的角色。腺病毒介導(dǎo)的huTNFa基因轉(zhuǎn)染huUCB-MSCs具有高效性。攜帶huTNFa基因的huUCB-MSCs與絨癌耐藥細(xì)胞株JEG-3/VP16共培養(yǎng)后，逆轉(zhuǎn)了JEG-3/VP16的耐藥性，而且JEG-3/VP16對(duì)感染huTNFa基因的huUCB-MSCs有定向趨化作用。轉(zhuǎn)基因間充