IGFBP-6對缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用研究.pdf

1、氧是多數(shù)生物體賴以生存的代謝原料,在物種生存的自然環(huán)境中,缺氧是一種常見的現(xiàn)象。為了適應(yīng)缺氧環(huán)境,生物體進(jìn)化出了一系列感知并應(yīng)激環(huán)境缺氧的機制。血管生成便是其中一種。缺氧是血管生成的重要刺激因子。目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)缺氧參與的血管生成調(diào)控機制均為正反饋調(diào)節(jié)機制,即缺氧促進(jìn)血管生成。而是否存在缺氧誘導(dǎo)性血管生成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制,目前尚不清楚。
　　 IGF(insulin-like growth factor,胰島素樣生長因子)是體

2、內(nèi)重要的生長因子,它在組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,機體的生長發(fā)育及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用。目前,大量的研究已經(jīng)證實了IGF系統(tǒng)參與血管生成的調(diào)控過程。IGF和胰島素在早期血管生成過程中起到應(yīng)激或增強缺氧效應(yīng)的作用。另一方面,IGF信號系統(tǒng)部分成員的基因表達(dá)也受缺氧調(diào)控。因此,本研究的目的之一是檢測在血管內(nèi)皮細(xì)胞中基因表達(dá)受缺氧調(diào)控的IGF信號系統(tǒng)分子,特別是6個結(jié)合蛋白IGFBP-1～6。針對這一研究目的,我們以體外培養(yǎng)的大

3、鼠腦微動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞為材料,用半定量RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn),大鼠腦微動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)6個結(jié)合蛋白中的IGFBP-6,且大鼠腦微動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中IGFBP-6的基因表達(dá)受缺氧上調(diào)。我們以半定量RT-PCR以及實時熒光定量PCR的方法檢測了人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)IGFBP-6的表達(dá)情況,檢測結(jié)果證實HUVEC中IGFBP-6的基因表達(dá)同樣受缺氧上調(diào)。
　　 在以上初步研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們從以下幾個方面進(jìn)行了

4、深入研究:1)研究IGFBP-6基因表達(dá)受缺氧調(diào)控的機制;2)確定IGFBP-6在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的生理意義,即:IGFBP-6對于血管生成的調(diào)控作用;3)研究IGFBP-6影響血管生成的分子機制。
　　 研究方法包括:1)半定量RT-PCR和Real-Time PCR檢測物理缺氧及CoCl2模擬的化學(xué)缺氧對血管內(nèi)皮細(xì)胞IGFBP-6表達(dá)模式的影響;2)序列分析IGFBP-6啟動子及增強子結(jié)構(gòu)域內(nèi)是否存在反式作用元件HRE及H

5、AS序列;3)采用體外血管生成模型,通過Malrigel實驗系統(tǒng)驗證體外重組IGFBP-6蛋白對血管生成的影響及其IGF配體依賴性;4)以轉(zhuǎn)基因斑馬魚flkl:gfp)為模型驗證IGFBP-6對于胚胎發(fā)育血管生成的影響;5)以異體移植實體瘤為腫瘤模型研究IGFBP-6對于腫瘤血管生成的影響;6)蛋白免疫印跡檢測HIF-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的激活情況以及血管生成相關(guān)信號通路的激活情況;7)利用信號通路特異性抑制劑及體外血管生成模型找到IGFB

6、P-6抑制血管生成的信號通路。
　　 利用以上研究方法,我們發(fā)現(xiàn):1)缺氧上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中IGFBP-6的基因表達(dá),而且缺氧對IGFBP-6基因表達(dá)的調(diào)控作用可能是通過缺氧誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1來實現(xiàn)的;2)IGFBP-6能夠抑制體外血管生成,這種抑制作用不依賴于IGFBP-6與IGF配體的結(jié)合;3)在體外血管生成模型中,IGFBP-6可以拮抗VEGF對血管生成的促進(jìn)作用;4)在體內(nèi)血管生成模型中,IGFBP-6既可以抑制斑