日蟾蜍它靈對(duì)VEGF誘導(dǎo)血管生成影響的研究.pdf

1、目的:日蟾蜍它靈(CS-6)，屬于中藥蟾酥中所含有的蟾蜍甾烯內(nèi)酯類化合物。前期研究表明CS-6在抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和炎癥反應(yīng)中具有良好效果。但目前CS-6對(duì)血管新生的影響及其潛在的分子機(jī)制還了解甚少。本實(shí)驗(yàn)主要探討CS-6抑制VEGF誘導(dǎo)人臍靜脈HUVECs細(xì)胞的增殖、管形成能力以及血管生成的分子機(jī)制。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)不同濃度日蟾蜍它靈(CS-6)對(duì)VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的影響;采用劃

2、痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦免疫熒光方法檢測(cè)CS-6對(duì)VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響。此外，通過(guò)管形成、球狀體成芽、小鼠主動(dòng)脈環(huán)等體外實(shí)驗(yàn)研究CS-6對(duì)VEGF刺激后血管新生的影響;采用基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)評(píng)估CS-6對(duì)VEGF刺激的小鼠體內(nèi)血管新生的影響。為尋找CS-6的作用靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用分子對(duì)接法，在體外模擬CS-6與VEGFR-2的相互作用。利用Western blot、免疫熒光、免疫共沉淀等手段來(lái)探索

3、CS-6抑制血管生成的潛在機(jī)制。
　　結(jié)果:日蟾蜍它靈(CS-6)在體外實(shí)驗(yàn)中顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和管形成，并且在C57/BL6小鼠體內(nèi)抑制基質(zhì)膠栓中血管的形成。本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬以及免疫共沉淀的方法，發(fā)現(xiàn)CS-6可以結(jié)合到VEGFR-2的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，阻斷ATP與VEGFR-2的結(jié)合而不影響VEGF與VEGFR-2的結(jié)合，從而降低VEGFR-2的磷酸化水平，抑制其生理活性，繼而抑制

4、VEGFR-2所介導(dǎo)的下游信號(hào)通路;同時(shí)，Western blot檢測(cè)表明CS-6可以顯著抑制由VEGF誘導(dǎo)的VEGFR-2的磷酸化;此外，通過(guò)siRNA敲低VEGFR-2，進(jìn)一步驗(yàn)證了CS-6可以通過(guò)抑制VEGFR-2信號(hào)通路激活，發(fā)揮抑制血管新生的作用。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)日蟾蜍它靈(CS-6)通過(guò)抑制VEGFR-2信號(hào)通路的激活而產(chǎn)生抑制血管生成的作用。本研究表明，日蟾蜍它靈在治療與血管新生相關(guān)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。