表皮腫瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分：表皮腫瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)
　　目的:
　　皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)在人類皮膚惡性腫瘤中是最常見的，其生長(zhǎng)過程分為兩個(gè)階段，分別為無血管期和血管期，發(fā)展過程從無血管緩慢生長(zhǎng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖俚脑鲩L(zhǎng)，當(dāng)血液供應(yīng)不足，不能滿足腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育的需要時(shí)，將導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部缺氧，從而引起一系列促進(jìn)血管新生因子的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生新

2、的血管的形成。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開血液營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，而新生血管的生成將保證腫瘤獲得充足的營(yíng)養(yǎng)供給，導(dǎo)致腫瘤得以迅速生長(zhǎng)并可對(duì)周圍組織浸潤(rùn)、侵襲和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤新生血管生成過程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)發(fā)揮非常重要的作用。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究的目的是探討皮膚基底

3、細(xì)胞癌(BCC)及皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，并分析它們的相關(guān)性及臨床意義。
　　方法:
　　收集本院病理科及皮膚病理研究室2010年1月2014年12月存檔皮膚癌組織蠟塊，BCC56例，cSCC46例，共102例，其中男性61例、女性41例，年齡中位數(shù)為58(26-90)歲。選擇同一時(shí)期采集的正常皮膚組織標(biāo)本40例做為對(duì)照，其中男性22例、女性18例

4、，年齡中位數(shù)為44(20-68)歲。病例組與正常對(duì)照組，均無合并重要臟器疾病史，無放療及化療等治療病史。病例組與對(duì)照組之間年齡、性別等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取材部位分別來自頭面部、軀干、四肢及會(huì)陰等部位，應(yīng)用即用型快速免疫組化MaxVisionTM法檢測(cè)56例皮膚BCC、46例cSCC和40例采集的正常皮膚組織樣本中的HIE-1α和VEGF的表達(dá)。采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用兩個(gè)樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行分析

5、，采用x2檢驗(yàn)和Scheffe方法對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，采用計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)不符合雙變量正態(tài)分布資料進(jìn)行分析，α=0.05作為顯著性水準(zhǔn)，P＜0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、VEGF陽(yáng)性染色主要定位在細(xì)胞的胞質(zhì)中，部分血管的內(nèi)皮細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞也可見到弱表達(dá)，新生血管旁的腫瘤細(xì)胞可見到高度表達(dá)。在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)中，VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為33.93％(19/56);在皮膚

6、鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中，VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為67.39％(31/46);在正常皮膚中，VEGF蛋白表達(dá)率為12.50％(5/40)。與正常皮膚相比，在BCC和cSCC中VEGF呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);并且VEGF的表達(dá)在cSCC中又明顯高于BCC(P＜0.05)。
　　2、HIF-1α陽(yáng)性染色主要定位在腫瘤細(xì)胞胞漿中，也可偶見于胞核著色，在腫瘤壞死區(qū)域的周邊也可見到陽(yáng)性細(xì)胞，在部分血管的內(nèi)皮細(xì)

7、胞中也可見到陽(yáng)性著色。正常皮膚則呈現(xiàn)陰性表達(dá)。在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)中，HIF-1α蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為48.32％(27/56);在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中，HIF-1α蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為82.60％(38/46);在正常皮膚中，HIF-1α蛋白無表達(dá)。與正常皮膚相比較，在BCC和cSCC中，HIF-1α呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、在BCC與cSCC中，VEGF陽(yáng)性病例中有5例HIF-1

8、a呈現(xiàn)陰性;HIF-1a陽(yáng)性病例中有20例VEGF呈現(xiàn)陰性，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.536，P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　在皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)中，VEGF和HIF-1α高表達(dá)，表明兩者通過促進(jìn)皮膚腫瘤新生血管的生成來促進(jìn)BCC與cSCC的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。VEGF表達(dá)和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在促進(jìn)BCC與cSCC的生長(zhǎng)發(fā)展、浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用

9、。
　　第二部分：缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）小干擾RNA對(duì)皮膚腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)影響
　　目的:
　　大多數(shù)研究表明，HIF-1α調(diào)控著缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的多種基因如血管生成素、血小板源性生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)等的生成，因而可將其作為缺氧的固有標(biāo)志并且可為腫瘤的發(fā)展提供一個(gè)更為準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在BCC和cSCC組織中，HIF-1α及其下游的靶基因VEG

10、F的表達(dá)均是增高的，HIF-1α在VEGF啟動(dòng)子上的位點(diǎn)與其結(jié)合，從而啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。在BCC和cSCC中，VEGF與HIF-1α的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可共同促進(jìn)腫瘤血管的生成和細(xì)胞的增殖。目前，對(duì)于BCC和cSCC的治療，仍以手術(shù)方法為豐，不適合手術(shù)或者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者可行放療和化療。放療和化療雖能有效消滅腫瘤細(xì)胞，但很難實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的靶向治療，在治療過程中導(dǎo)致很多正常細(xì)胞死亡，對(duì)人體造成損害。因此

11、，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療是重要的發(fā)展方向。先前的研究提示了缺氧機(jī)制可能參與了BCC和cSCC的發(fā)生和發(fā)展。鑒于HIF-1α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用，人們?cè)絹碓街匾曇訦IF1α為靶點(diǎn)的腫瘤生物治療方法，抑制腫瘤細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞缺氧信號(hào)的傳遞等治療方法已成為新的研究方向，而針對(duì)HIF-1α靶基因的RNAi(RNA interference，RNAi)方法可以使其結(jié)構(gòu)域失活或者抑制HIF-1α基因的表達(dá)，從而阻斷H

12、IF-1α的生物學(xué)作用，將是一個(gè)有效的方法來控制惡性腫瘤的發(fā)展，提高患者的生存率。本實(shí)驗(yàn)研究目的是通過RNAi方法抑制HIF-1α基因表達(dá)，并探討HIF-1α-siRNA對(duì)皮膚腫瘤細(xì)胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平的影響。
　　方法:
　　采用廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，構(gòu)建目的基因的siRNA和陰性對(duì)照NC(Negati ve Control)，其序列由廣州市

13、銳博生物科技有限公司提供。構(gòu)建針對(duì)HIF-1α的特異性小干擾RNA，同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞，在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)3天，提取細(xì)胞總RNA和蛋白。采用RT-qPCR方法和Western blot方法檢測(cè)HIF-1αmRNA和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平變化。采用凝膠分析軟件分析條帶光密度值，計(jì)算RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值，表達(dá)Western

14、 Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料兩個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，以α=0.05作為顯著性水準(zhǔn)，P＜0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、RT-qPCR與Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA皮膚腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)后，與空轉(zhuǎn)染對(duì)照相比，siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3對(duì)HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)均有抑

15、制作用(P＜0.05)。
　　2、RT-qPCR與Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA組與空轉(zhuǎn)染對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照組相比，低氧培養(yǎng)人皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞中VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　通過采用RNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α基因的表達(dá)，可以抑制低氧條件下皮膚鱗癌細(xì)胞與血管發(fā)生相關(guān)基因VEGF表達(dá)的上調(diào)機(jī)制，導(dǎo)致VEGF