缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)促血管生成作用研究.pdf

1、目的:研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-induciblefactor1α，HIF-1α)基因轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞(humanmesenchymalstemcells，hMSCs)的體內(nèi)促血管生成作用，為促進(jìn)組織工程骨血管化提供新的方法和策略。 方法:1.HIF-1α基因轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞：將構(gòu)建的pIRES3/HIF-1α逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，制備含目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液，感染hMSCs，獲得穩(wěn)定高表達(dá)H

2、IF-1α的hMSCs。用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因hMSCs表達(dá)HIF-1α的水平，用免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因hMSCs在缺氧和常氧條件下HIF-1α蛋白的存在情況。 2.轉(zhuǎn)基因hMSCs體內(nèi)促血管生成的研究：將轉(zhuǎn)基因hMSCs和未轉(zhuǎn)基因的hMSCs分別接種到13d的雞胚絨毛尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)，3d后在解剖顯微鏡下原位觀察并拍攝血管，然后將CAM用Bouin's液固定，制片

3、，在顯微鏡下觀察并攝像。用Image-ProPlus4.5測(cè)量并分析血管面積。 結(jié)果:1.感染后的hMSCs經(jīng)G418篩選后逐漸形成克隆，克隆中的hMSCs均表達(dá)EGFP，在倒置熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光。 2.缺氧條件下，轉(zhuǎn)基因hMSCs中HIF-1αmRNA表達(dá)較未轉(zhuǎn)基因的hMSCs明顯增高。 3.免疫組化法檢測(cè)HIF-1α蛋白結(jié)果顯示：缺氧組轉(zhuǎn)基因hMSCs細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色，染色結(jié)果為陽性；常氧組轉(zhuǎn)基因

4、hMSCs細(xì)胞核未著色，染色結(jié)果為陰性。 4.CAM原位觀察：對(duì)照組CAM細(xì)胞團(tuán)周圍血管走行稍曲折，血管生成不明顯；實(shí)驗(yàn)組CAM細(xì)胞團(tuán)周圍出現(xiàn)大量新生血管，以細(xì)胞團(tuán)為中心呈放射狀排列。 5.CAM標(biāo)本顯微鏡下觀察：實(shí)驗(yàn)組CAM可見大量新生血管以細(xì)胞團(tuán)為中心呈放射狀排列形成輻條輪狀。此外，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部可見密集的新生血管網(wǎng)。對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)周圍無明顯血管生成。試驗(yàn)組CAM血管密度較對(duì)照組明顯增高。 6.圖像分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)

5、組CAM較對(duì)照組CAM血管面積明顯增多，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 結(jié)論:1.HIF-1α基因能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞并得到強(qiáng)制表達(dá)。 2.轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧條件下細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α能穩(wěn)定存在；常氧條件下細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α不能穩(wěn)定存在，。表明利用轉(zhuǎn)基因hMSCs促進(jìn)血管生成具有較好的可調(diào)控性。 3.轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的hMSCs有明顯的促血管生成作用。 4.利用HIF-