中國中性粒細胞MPO完全缺陷家系的分子機制研究.pdf

1、【目的】
　　通過對1個中性粒細胞髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)完全缺陷家系進行系統的分子遺傳學研究,闡明中國MPO完全缺陷家系的分子遺傳學特征和MPO分子遺傳改變對其生理學、病理學作用的影響水平及其分子機制。為進一步開展MPO生物合成機制及其生理和病理學研究提供有力的試驗材料支持。
　　【方法】
　　1.收集家系血液樣本,分離中性粒細胞,并抽提基因組。設計引物擴增MPO基因轉錄調控區(qū)和12個外

2、顯子區(qū),分段擴增MPO基因。比較分析家系樣本與正常對照間基因序列差異,繪制家系圖。
　　2.對中性粒細胞內MPO進行活性檢測、MPO細胞化學染色以及通過熒光顯微鏡觀察MPO熒光抗體與MPO的雜交信號,從而分析MPO缺陷中性粒細胞內MPO的氧化活性、表達水平以及定位情況。聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分離中性粒細胞勻漿樣

3、本,利用MPO抗體通過Western-Blot分析中性粒細胞中MPO的存在情況。
　　3.分別提取放線菌酮(Cycloheximide,CHX)處理前后中性粒細胞總RNA,利用real-timeRTPCR技術檢測MPOmRNA相對正常對照的表達水平,研究此突變分子機制。
　　【結果】
　　1.通過對家系基因組序列分析,發(fā)現患者MPO基因11號外顯子第1805個堿基由G突變?yōu)锳(TGG>TAG),提前產生終止密碼子,為W

4、602X純合子;而其家庭成員中患者母親及兒子均為W602X雜合子,此位點為G/A。家系圖譜提示此缺陷為常染色體隱性遺傳。
　　2.患者中性粒細胞中MPO活性不到正常對照總量的5％、MPO化學染色完全陰性、熒光顯微鏡顯示MPO熒光染色陰性、Western-Blot顯示患者MPO完全缺陷,而正常對照染色陽性明顯。患者女兒與兒子以上結果均接近正常對照一半。
　　3.Real-timeRTPCR顯示患者中性粒細胞MPOmRNA表達水

5、平不到正常對照1%,而中性粒細胞經CHX處理后MPOmRNA表達水平明顯增高。提示中性粒細胞內MPOmRNA存在降解,而此降解和無義突變介導的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)密切相關。
　　【結論】
　　本實驗發(fā)現MPO完全缺陷患者一例,缺陷為11號外顯子第1805位堿基G突變?yōu)锳(TGG>TAG)所致(NG_009629.1:c.1805G>A),即W602X純合子突變。這一突變