SAA通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs參與RA炎癥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps,NETs），是由中性粒細(xì)胞在適當(dāng)?shù)拇碳は滦纬傻挠扇旧|(zhì)及粘附其上的顆粒蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。NETs形成后能夠發(fā)揮免疫防御的功能，此外，它參與了多種病理過(guò)程。在多種自身免疫病的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NETs形成異常，并且在多個(gè)方面影響了病程進(jìn)展。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A,SAA），作為急性時(shí)相蛋白的一種，是炎癥反應(yīng)的重要參與

2、者。本研究組之前研究發(fā)現(xiàn)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）患者的血清和滑膜組織中SAA表達(dá)量升高，并與RA的疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)關(guān)系。SAA可作用于中性粒細(xì)胞能夠引起多種效應(yīng)，但其是否與 NETs的形成有關(guān)尚未有研究報(bào)道。SAA作用于中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞生成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）。而ROS的形成是NETs形成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，且有報(bào)道ROS能夠直接誘導(dǎo)中

3、性粒細(xì)胞形成NETs，推測(cè)SAA可誘導(dǎo)NETs形成。目前有關(guān)NETs在RA中的研究剛起步，相關(guān)文獻(xiàn)只有零星報(bào)道，并存在矛盾之處。本研究的主要目的是探究RA患者體內(nèi)NETs的形成，及其是否受SAA的誘導(dǎo)以及NETs在RA炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法：
　　1. ELISA的方法檢測(cè)血清中的MPO、NE含量，熒光染色方法相對(duì)定量地檢測(cè)RA患者與健康對(duì)照血清中的細(xì)胞外DNA含量。
　　2.免疫熒光法檢測(cè)并觀察RA和OA患者滑

4、膜組織中的NETs。
　　3. Pearson線(xiàn)性相關(guān)分析RA血清中NETs（MPO）含量與RA疾病活動(dòng)度（相關(guān)指標(biāo)：ESR、CRP和DAS28）的相關(guān)性。
　　4. Pearson線(xiàn)性相關(guān)分析RA血清中NETs（MPO）含量與血清中相應(yīng)抗體含量（anti-CCP、RFIgG、RFIgA）的相關(guān)性。
　　5. MTT實(shí)驗(yàn)分析NETs對(duì)體外培養(yǎng)的RAFLS和HUVECs增殖的影響。
　　6.密度梯度離心法分離健康志

5、愿者外周血中的中性粒細(xì)胞，分離后臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力，HE染色分析細(xì)胞純度。
　　7.將分離獲得的中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，并分為SAA組、LPS組和陰性對(duì)照組，分別加入SAA、LPS和tris-HCL緩沖液作為刺激劑，誘導(dǎo)NETs的形成。熒光染色法觀察上述培養(yǎng)細(xì)胞形成NETs細(xì)胞的百分率。
　　8. ELISA的方法定量檢測(cè)上述培養(yǎng)細(xì)胞上清中的h3含量。
　　結(jié)果：
　　1.RA組的MPO水平（4.257±0.48

6、40mg/L），NE水平（1.992±0.07389mg/L），均顯著高于健康對(duì)照組：MPO（1.054±0.1130mg/L），NE（1.707±0.06374 mg/L）(P<0.05)。RA組的DNA含量（17.51±1.319RFU）顯著低于健康對(duì)照組（22.68±0.9035RFU）(P<0.05)。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，相對(duì)于OA患者，RA滑膜組織中觀察到更多的NETs。
　　3. pearson線(xiàn)性相關(guān)分

7、析結(jié)果顯示，RA患者血清中的MPO水平與ESR（R2=0.365, P<0.05）和DAS28（R2=0.288,P<0.05）呈正相關(guān)，而與血清中的CRP(R2=0.0256,P>0.05)含量無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　4. Pearson線(xiàn)性相關(guān)分析結(jié)果顯示，RA患者血清中的MPO水平與血清中抗體含量（anti-CCP、RFIgG、RFIgA）無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　5. NETs能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的FLS與HUVECs的增殖。

8、　　6. HE染色鑒定分離的細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞純度在95％以上，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定分離的中性粒細(xì)胞活力在95%以上。
　　7.形成NETs的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率，SAA組顯著高于陰性對(duì)照（Tris-HCL緩沖液，NC組）組（SAA：0.168±0.008；NC：0.039±0.006；F=46.08， P<0.05, n=12）。
　　8.細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3的含量SAA組也顯著高于陰性對(duì)照組（SAA:34.24±0.57；NC

9、：24.03±0.74；F=56.25，P<0.05，n=12）。
　　結(jié)論：
　　1. RA患者血清中的MPO含量和NE含量顯著高于健康對(duì)照組，提示RA患者血清中可能有 NETs形成的增高。免疫熒光結(jié)果顯示 RA滑膜組織中 NETs的形成顯著高于OA，說(shuō)明RA滑膜組織中NETs形成增多。以上結(jié)果提示至少在RA滑膜組織局部NETs形成增多。
　　2. MPO含量與DAS28、ESR呈正相關(guān)關(guān)系，提示MPO與RA炎癥反應(yīng)