氣道炎癥性疾病中炎癥小體調(diào)控IL-17A+γδT細(xì)胞-中性粒細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　支氣管哮喘是一種復(fù)雜的氣炎癥反應(yīng)綜合征，以氣道阻塞、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)。難治性哮喘以中性粒細(xì)胞氣道炎癥為主。臭氧暴露是誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥的方法，但是其具體機(jī)制尚未明確。此外，臭氧暴露還可以導(dǎo)致哮喘患者急性發(fā)作。臭氧介導(dǎo)的氣道炎癥的特點(diǎn)是中性粒細(xì)胞浸潤、氣道高反應(yīng)性以及前炎癥因子的釋放，如TNFα、IL-6、MIP-21-4。
　　目前的很多研究表明，T細(xì)胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。T

2、細(xì)胞可以通過產(chǎn)生細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2細(xì)胞的另一種CD4+T細(xì)胞的新亞型，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)哮喘患者體內(nèi)IL-17水平升高。IL-17是一種促炎因子，可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞反應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A與IL-17F的表達(dá)水平與哮喘病人的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，重度哮喘患者血清中IL-17的水平較輕、中度患者明顯增高，激素抵抗的重癥哮喘患者IL-17A的水平與氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量呈

3、正相關(guān)5-8。
　　炎癥小體9-11是由胞漿內(nèi)多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體能夠識(shí)別PAMPs或者宿主來源的DAMPs，招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-19?；罨腃aspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子9-11。IL-1β是IL-1家族的成員之一12，作為一種重要的炎癥調(diào)節(jié)因子參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。炎癥小體參與很多與IL-1β相關(guān)的疾病如cryopyrin-asso

4、ciatedperiodic綜合征、腸炎以及2型糖尿病13。IL-1β在抗感染免疫與慢性炎癥相關(guān)的組織損傷中都起重要作用。IL-1β聯(lián)合IL-6以及IL-23可通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IFR4和RORγt的表達(dá)促進(jìn)Th17分化14。Caspase-1和IL-1信號(hào)通路都與臭氧介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞氣道炎癥有關(guān)15，但其具體機(jī)制未明。
　　γδT細(xì)胞是一種T細(xì)胞的亞群，表達(dá)TCRγδ，是區(qū)分于與αβT細(xì)胞的另一種T細(xì)胞亞型16-18。γδT細(xì)胞屬

5、于非MHC限制性免疫細(xì)胞，可不通過抗原識(shí)別過程直接識(shí)別抗原，但識(shí)別范圍較窄。外周血的γδT細(xì)胞占總T細(xì)胞數(shù)量的5％以下。組織γδT細(xì)胞主要分部在肺、皮膚、尿道以及小腸的粘膜中。γδT細(xì)胞參與了很多生物學(xué)過程如感染性疾病，自身免疫性疾病，及抗腫瘤免疫19,20。分泌IL-17的γδT細(xì)胞在腫瘤生長21及腎損傷22中都起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用23。在COPD24和過敏性疾病患者25體內(nèi)，γδT細(xì)胞比例增高。已有研究報(bào)道，γδT細(xì)胞參與臭氧誘導(dǎo)的中性粒

6、細(xì)胞氣道炎癥，但其具體機(jī)制未明。
　　由于炎癥小體-IL-1信號(hào)通路及IL-17均在中性粒細(xì)胞氣道炎癥中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，本課題假設(shè)臭氧可以活化炎癥小體，促進(jìn)成熟型IL-1β產(chǎn)生。微環(huán)境中的IL-1β可以活化γδT細(xì)胞分泌IL-17，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞氣道炎癥。本研究在臭氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞氣道炎癥模型中，通過整體模型、體外細(xì)胞培養(yǎng)等方法，闡明炎癥小體在哮喘發(fā)病中對(duì)IL-17+γδT細(xì)胞/中性粒細(xì)胞炎癥調(diào)控的關(guān)鍵分子機(jī)制，為開發(fā)研究治

7、療氣道慢性炎癥性疾病新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　第一部分 臭氧誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥和IL-17A+γδT細(xì)胞
　　目的:建立臭氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞氣道炎癥模型，觀察IL-17A的變化，尋找IL-17A的分泌來源。
　　方法:C57/BL6小鼠（雌性，6-8周）隨機(jī)分為2組，每組5-7只小鼠。分別予以空氣(Air)和臭氧(Ozone)暴露72小時(shí)，停止暴露后24小時(shí)處死小鼠。取小鼠BALF，進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)與細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

8、。Elisa方法測定肺組織炎癥因子的表達(dá)。BCA法測定BALF蛋白濃度。病理切片HE染色觀察氣道炎癥細(xì)胞浸潤。提取肺組織淋巴細(xì)胞流式分析IL-17A+細(xì)胞的比例及其分泌來源。Il17a-/-小鼠臭氧暴露，觀察其BALF炎癥細(xì)胞、炎癥因子及BALF總蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功地構(gòu)建了中性粒細(xì)胞氣道炎癥模型。小鼠BALF炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，肺組織炎癥因子IL-1β，IL-18，IL-17A，G-CSF, IP-10表達(dá)明顯增加，B

9、ALF總蛋白水平明顯增加。臭氧誘導(dǎo)氣道炎癥的同時(shí)伴隨著IL-17A+淋巴細(xì)胞的增多。分泌IL-17A的淋巴細(xì)胞主要為TCRγδ+γδT細(xì)胞，而不是TCRβ+細(xì)胞。Il17a-/-小鼠阻斷IL-17A可以有效地抑制臭氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞氣道炎癥和炎癥因子分泌。
　　結(jié)論:臭氧暴露可以成功地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥，這種氣道炎癥是由IL-17A和IL-17A+γδT細(xì)胞介導(dǎo)的。
　　第二部分 臭氧暴露活化炎癥小體和IL-1R通路

10、r>　　目的:探討臭氧介導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥的分子機(jī)制。
　　方法:C57/BL6小鼠分為Air組和Ozone組，Ozone組小鼠暴露與0.7 ppm臭氧環(huán)境中，分別在暴露中6h、12h、24h、72h，及暴露后6h、12h、24h、48h處死小鼠，觀察肺組織勻漿中IL-1β動(dòng)態(tài)變化。WT小鼠和Il1r1-/-小鼠分別分成Air組和Ozone組，Ozone組小鼠同時(shí)暴露與0.7 ppm臭氧環(huán)境中72小時(shí)，停止暴露后24小時(shí)處理小鼠

11、。觀察BALF細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)絕對(duì)值變化、Elisa方法檢測肺組織勻漿中炎癥小體相關(guān)炎癥因子及其他炎癥因子表達(dá)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測IL-17A+γδT細(xì)胞比例變化、RT-qPCR方法觀察轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA水平變化。從WT小鼠肺組織中提取原代巨噬細(xì)胞，MitoSOX方法檢測線粒體超氧化、FAM-YVAD-FMK FLICA試劑檢測caspase-1活化。提取小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)DNA，Q-PCR方法檢測細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA相對(duì)表

12、達(dá)量。Air組和Ozone組小鼠原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，予以LPS或LPS聯(lián)合ATP干預(yù)后，觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β的表達(dá)。應(yīng)用caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk腹腔給藥，觀察小鼠BALF炎癥細(xì)胞絕對(duì)值變化、Elisa方法檢測肺組織炎癥因子變化、流式細(xì)胞技術(shù)檢測IL-17A+γδT細(xì)胞比例變化。
　　結(jié)果:臭氧暴露后，肺組織勻漿中的IL-1β緩慢升高，并且持續(xù)到停止暴露。Il1r1-/-小鼠較WT小鼠BALF細(xì)胞總

13、數(shù)及巨噬細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值顯著降低。肺組織炎癥小體相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-18顯著降低。其他炎癥因子G-CSF、IP-10顯著降低。IL-17A+γδT細(xì)胞比例明顯降低。轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA水平明顯降低。臭氧暴露后，肺組織巨噬細(xì)胞MitoSOX平均熒光強(qiáng)度明顯增加、FAM-YVAD-FMK FLICA平均熒光強(qiáng)度明顯增加、肺組織巨噬細(xì)胞線粒體DNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加。腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)上清中，不同

14、干預(yù)方式Ozone組小鼠較Air組小鼠IL-1β水平均明顯增加。Ac-YVAD-cmk腹腔給藥小鼠較對(duì)照組小鼠淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平明顯降低、炎癥因子IL-1β、IL-17、KC、G-CSF、IP-10明顯降低。IL-17A+γδT細(xì)胞比例明顯降低。
　　結(jié)論:臭氧暴露導(dǎo)致線粒體超氧化和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體DNA增多，通過caspase-1-IL-1-γδT細(xì)胞通路增加IL-17的分泌，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞氣道炎癥。
　　第三部分

15、 TFI保護(hù)臭氧介導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥
　　目的:探討TNFR2-Fc-IL-1 ra(TFI)對(duì)臭氧介導(dǎo)中性粒細(xì)胞氣道炎癥的作用及機(jī)制。
　　方法:NS干預(yù)小鼠和TFI10mg、、50mg干預(yù)小鼠分別分成Air組和Ozone組，Ozone組小鼠同時(shí)暴露與0.7 ppm臭氧環(huán)境中72小時(shí)，停止暴露后24小時(shí)處理小鼠。觀察不同濃度TFI干預(yù)小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)絕對(duì)值變化。Elisa方法檢測不同濃度TFI干預(yù)肺組織

16、勻漿中炎癥小體相關(guān)炎癥因子及中性粒細(xì)胞趨化因子表達(dá)。Elisa方法檢測不同濃度TFI干預(yù)肺組織勻漿中IL-17A的表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測IL-17AγδT細(xì)胞比例變化。
　　結(jié)果:TFI干預(yù)小鼠較NS干預(yù)小鼠中性粒細(xì)胞絕對(duì)值顯著降低。肺組織勻漿中炎癥小體相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-18顯著降低，中性粒細(xì)胞趨化因子KC、MIP-2顯著降低。肺組織勻漿中IL-17A表達(dá)明顯降低。IL-17A+γδT細(xì)胞比例明顯降低。
　　結(jié)論