Notch分子參與嗜中性粒細(xì)胞清除副溶血弧菌的動態(tài)變化研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種人獸共患的致病菌，不僅會導(dǎo)致海洋動物的弧菌病，還能引起人類患敗血癥、腸胃炎和傷口感染。嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用是機(jī)體天然免疫中對抗感染和損傷的一個重要防御機(jī)制。由于斑馬魚在受精后的前三周只存在先天免疫，使它具有哺乳動物等其他實驗?zāi)Ｐ筒痪邆涞膬?yōu)勢，目前斑馬魚已廣泛的應(yīng)用于宿主和病原體相互作用的研究中，尤其在天然免疫應(yīng)答研究中具有突出優(yōu)勢。
　　為了探究副溶血弧菌和

2、斑馬魚嗜中性粒細(xì)胞之間的動態(tài)變化，以及Notch分子參與天然免疫應(yīng)答的作用，本實驗首先通過三親本雜交的方法將帶有紅色熒光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Vp57中，獲得了熒光標(biāo)記的細(xì)菌，命名為Vp57RFP。檢測了RFP標(biāo)記的質(zhì)粒在Vp57中的穩(wěn)定性和Vp57在標(biāo)記前后生長曲線及毒力的差異，為后續(xù)示蹤Vp57RFP感染嗜中性粒細(xì)胞實驗提供了寶貴的材料。之后，觀察了Vp57RFP在斑馬魚體內(nèi)與嗜中

3、性粒細(xì)胞之間的動態(tài)變化，建立了人工感染3dpf(days post fertilization)斑馬魚幼魚的實驗?zāi)Ｐ?。接下來，通過Q-PCR檢測了Vp57RFP在浸泡和注射感染3dpf的wt和notch1a-/-斑馬魚后，嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和補體系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)情況，為研究Notch分子參與斑馬魚先天免疫的作用機(jī)制提供借鑒。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞因子等免疫相關(guān)基因在先天免疫中的作用，最后我們采用生物信息學(xué)軟件分析了細(xì)胞因子tnf

4、b、il11b和il13基因5’上游2000bp左右的序列，并預(yù)測了其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，克隆啟動子，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切和測序鑒定，最后通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測重組載體的活性。
　　實驗結(jié)果如下：
　　（1）通過三親本雜交成功將Vp57菌株標(biāo)了記紅色熒光蛋白質(zhì)粒，并且標(biāo)記后質(zhì)粒穩(wěn)定，在 M9無機(jī)培養(yǎng)基中傳代320代后質(zhì)粒穩(wěn)定率維持在18.2％。Vp57RFP和Vp57的生長曲線相似，0.3h之內(nèi)為對數(shù)

5、增長期，2h后進(jìn)入穩(wěn)定期。毒力也未發(fā)生明顯改變，Vp57的LD50為2.002x107CFU/ml，Vp57RFP的LD50為2.178x107CFU/ml。這些都為之后用Vp57RFP進(jìn)行示蹤實驗奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）斑馬魚的嗜中性粒細(xì)胞為圓形或類圓形，細(xì)胞核形態(tài)多樣，多為兩葉的分葉核。通過尾靜脈注射579CFU的Vp57RFP感染3dpf的斑馬魚，觀察到 Vp57RFP隨時間的推移，先后出現(xiàn)在尾部的注射部位、心臟、耳泡、眼睛

6、等，嗜中性粒細(xì)胞也由最初的注射部位遷移至各個感染的器官中，3h后，幼魚死亡，身體的各個部位基本全被細(xì)菌覆蓋，脊柱輕微彎曲，并且在體節(jié)中有少量Vp57RFP出現(xiàn)。當(dāng)注射劑量增加至974CFU，幼魚的死亡時間提前至約2.5h，魚體彎曲更加嚴(yán)重。
　　（3）用Vp57RFP浸泡和尾靜脈注射分別感染3dpf的wt和notch1a-/-斑馬魚，Q-PCR檢測嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和補體系統(tǒng)的相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，尾靜脈注射的感染

7、方式下，細(xì)胞因子如：il1b、ifnphil、ccl-c5a、cxcl8a和補體基因c3、c6、c9、bf、bf3都比浸泡感染表達(dá)量高，說明尾靜脈注射的感染方式引起的斑馬魚急性免疫反應(yīng)更為強烈。而且尾靜脈注射感染的wt組的細(xì)胞因子表達(dá)量都比notch1a-/-低，而wt組的補體基因中只有c6和c9的表達(dá)量比notch1a-/-組低，而其他補體基因的表達(dá)都比notch1a-/-組高。說明notch1a確實對先天免疫中嗜中性粒細(xì)胞有負(fù)向調(diào)控

8、作用，且不同的補體基因的應(yīng)答模式不同。
　?。?）tnfb的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點為：Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPalpha、NF-kappaB、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。il11b的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點包括：Oct-1、SRF、GR、RAR-alpha1、COUP、NF-kappaB、MEB-1、NF-1、AP-1。il13的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點包括：AP-1、GATA-1

9、、NF-1、C/EBPalpha、TBP、Oct-1。tnfb、il11b和 il13的啟動子區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，其5’側(cè)翼序列含有與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的TATA Box和CAAT Box轉(zhuǎn)錄元件并且將三種基因的啟動子片段插入pGL3-enhancer構(gòu)建pGL3-tnfb-promoter-enhancer、pGL3-il11b-promoter-enhancer、pGL3-il13-promoter-enhancer三種質(zhì)粒后，質(zhì)粒經(jīng)酶切

10、測序顯示酶切片段大小一致，序列正確；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)證實構(gòu)建的報告基因載體具有啟動子活性。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，成功構(gòu)建tnfb、il11b和il13基因啟動子雙熒光素酶報告基因表達(dá)載體，為研究細(xì)胞因子參與的免疫相關(guān)的信號通路之間的調(diào)控提供了有力的研究工具。
　　總之，本研究為探究Vp的熒光標(biāo)記手段提供了新的思路，構(gòu)建的Vp-斑馬魚嗜中性粒細(xì)胞人工感染的疾病模型為未來在臨床上監(jiān)測嗜中性粒細(xì)胞對Vp的清除效果提供了借鑒，