副溶血弧菌調(diào)控蛋白CalR功能的初步研究.pdf

1、背景：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種廣泛分布于淺海海水，入海港灣，海洋生物及鹽漬加工食品中，能引起人類感染患病的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌。人們?nèi)粽`食了生的或未被徹底煮熟的海產(chǎn)品，可能會被感染。副溶血弧菌主要能夠引起三種臨床綜合癥：腸胃炎、傷口感染和敗血癥。其中最常見是腸胃炎，癥狀包括腹瀉、腹痛、反胃嘔吐、頭痛和低熱。副溶血弧菌分泌多種毒力因子，主要包括耐熱直接溶血毒素（Thermostable dir

2、ect hemolysin，TDH），TDH相關(guān)溶血毒素（TDH-related hemolysin， TRH），III型分泌系統(tǒng)（The type III secretion systems，T3SS），VI型分泌系統(tǒng)（The type VI secretion systems，T6SS）及莢膜多糖等。其中TDH可在我妻血瓊脂平板上表現(xiàn)為神奈川現(xiàn)象陽性。目前在我國沿海地區(qū)，由副溶血弧菌感染引起的食源性疾病占這些地區(qū)食源性中毒病例的比例

3、越來越高，所以有必要對其致病機理進行深入探討。
　　LeuO是LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛存在于腸道致病菌中。首先被發(fā)現(xiàn)于沙門氏菌（Salmonella）中，且因其能激活亮氨酸合成基因座位leuABCD的轉(zhuǎn)錄而得名。在隨后的研究表明，LeuO具有解除靜默子H-NS對基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，并參與調(diào)控多種基因，因此被認為是重要的核心調(diào)控子。副溶血弧菌的calR基因位于菌株基因組I上，該基因長960 bp，G+C含量47.29％，編碼

4、分子量為36192.8，由319氨基酸殘基組成的蛋白。CalR是LeuO的同源蛋白，其自身的轉(zhuǎn)錄和表達受鹽度和Ca2+濃度的雙重調(diào)節(jié)。目前只知它具有抑制T3SS1毒力基因的表達和細菌群集性爬動能力（Swarming），但對其分子機制還一無所知。
　　目的：本文目的在于通過構(gòu)建副溶血弧菌calR基因的突變株、回補株和CalR蛋白表達株，進而對CalR功能進行初步研究。
　　方法：本研究首先利用自殺載體 pDS132同源重組的方

5、法構(gòu)建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的calR無痕突變株（ΔcalR），并在突變株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了回補株（ΔcalR/calR::pBAD33，簡稱C-ΔcalR）和攜帶有相關(guān)靶基因的LacZ菌株。通過測定并比較vopN基因（編碼T3SS1外膜蛋白）在WT/pBAD33、ΔcalR/pBAD33和C-ΔcalR中β-半乳糖苷酶活性的差異，來判定CalR對vopN的調(diào)控關(guān)系，明確ΔcalR是否為非極性突變株；其次，比較WT和calR突

6、變株在對應(yīng)激條件下的適應(yīng)性、菌落透明度、運動能力、生物膜的形成和細胞毒力等一系列的表型實驗結(jié)果，其中應(yīng)激環(huán)境選擇了溫度，鹽度和酸度三個不同的條件；利用構(gòu)建好的靶基因LacZ菌株進行β-半乳糖苷酶活性檢測，判斷調(diào)控因子CalR與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系；最后用重組克隆方法誘導表達蛋白，鎳柱純化后可得到純度高的CalRhis6蛋白，從而對其DNA活性分析和CalRhis6蛋白與靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合活性檢測奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果： CalR負

7、調(diào)控vopN的轉(zhuǎn)錄，且回補株的回補效果良好，表明本研究成功構(gòu)建了副溶血弧菌calR基因的無痕突變株和回補株。表型實驗中：在對溫度（4℃）應(yīng)激條件下的適應(yīng)性上，一定時間段內(nèi)（第二天），WT的適應(yīng)能力明顯高于ΔcalR；ΔcalR生物膜的形成能力高于WT；菌落透明度上，與WT相比，ΔcalR更加透明；在運動能力上，ΔcalR的爬動能力小于WT，而泳動能力與WT比較無顯著性差異；ΔcalR的細胞毒力和溶血活性都大于WT；LacZ報告基因融合實