不同來源副溶血弧菌分子分型及其毒力基因篩查.pdf

1、副溶血弧菌是魚蝦、貝類等海產(chǎn)品中重要的致病菌,近年來,隨著海產(chǎn)品越來越得到人們的青睞,副溶血弧菌已成為沿海地區(qū)主要的食源性致病菌,因此在海產(chǎn)品消費量較大的長三角地區(qū)沿海城市開展關(guān)于副溶血弧菌流行病學(xué)特征及其溯源研究顯得十分重要。
　　本研究選取了來自上海、寧波、舟山的109株臨床、食品和環(huán)境分離株,首先對其進行了毒力基因的篩查和血清分型研究,旨在了解該菌在長三角地區(qū)的毒力基因攜帶情況及血清型的分布特點,為副溶血弧菌的預(yù)防控制和致病

2、性分析提供相關(guān)參考數(shù)據(jù);在此基礎(chǔ)上,采用了ERIC-PCR分子分型方法,對109株副溶血弧菌基于基因片段大小及其多態(tài)性進行了分型研究,并建立了與傳統(tǒng)血清分型相結(jié)合的簡便、快速、有效的流行病學(xué)溯源方法;最后采用MLST技術(shù),對副溶血弧菌基于基因序列進行了分型研究,擴充了全球副溶血弧菌MLST數(shù)據(jù)庫信息,且在鑒定菌株是否流行株方面具有重要意義。
　　一、不同來源副溶血弧菌毒力基因篩查及潛在致病性分析
　　利用PCR方法對109株

3、副溶血弧菌分離株的毒力基因tdh、trh、toxRS/new、ORF8進行篩查,結(jié)果表明tdh的攜帶率最高(64.2％), trh攜帶率最低(7.3%),toxRS/new(39.4%)和ORF8(30.3%)介于兩者之間;同時,三種不同來源的菌株攜帶率差異大,臨床分離株四種攜帶率均為最高,而環(huán)境分離株則最低。在潛在致病性分析中,109株副溶血弧菌共有71株為潛在致病株,以tdh+/trh-型為主,占88.7%(63/71),僅有一株致

4、病性環(huán)境分離株為tdh-/trh+型,另有7株臨床致病株為tdh+/trh+;致病株有37株為潛在流行致病株,即tdh+/toxRS/new+,其中31株為ORF8陽性株。
　　二、不同來源副溶血弧菌分離株的血清分型
　　通過玻片凝集反應(yīng)對所有分離株進行了血清分型,結(jié)果表明:在所檢測到的26種血清型中,O3:K6和O4:K8所占比例較高,分別為20.7%和19.5%,合計達40.2%,其次為O4:K68,O1:K25,O3:

5、K68, O3:K25,O3:K8和O1:K6等;結(jié)合菌株來源分析表明:環(huán)境分離株的O和K血清型分布均呈現(xiàn)出更顯著的多樣性,且與食品和臨床分離株差異均較大。
　　三、不同來源副溶血弧菌分離株的ERIC-PCR分型
　　采用ERIC-PCR基因分型方法,結(jié)合聚類分析進行了各分離株之間的遺傳相關(guān)性比較,結(jié)果表明:ERIC-PCR指紋圖譜可將109株副溶血弧菌分為65個型,31個類群,分辨力指數(shù)為0.942,其中類群19為主導(dǎo)ER

6、IC群,聚集了38株分離株(30株臨床分離株、8株食品分離株),且 tdh攜帶率高達97.4%(37/38),僅有一株食品分離株為 tdh-/trh-菌株;親緣關(guān)系比較顯示:不同來源的分離株可聚為一類,其中有5個亞型中存在食品分離株與致病性分離株聚在一起,基因水平上存在一定的相關(guān)性,若結(jié)合菌株的分離時間、地點及其血清分型的結(jié)果,ERIC-PCR分型將是一種非常快速、有效的流行病學(xué)溯源方法。
　　四、不同來源副溶血弧菌分離株的MLS

7、T分型
　　本研究中,109株分離株 MLST分型結(jié)果具有較高的多樣性,共得到55個STs,其中新發(fā)現(xiàn)的ST型所占比例高達77.7%(40/55),新的等位基因型也多達78個,且均已通過數(shù)據(jù)庫管理員審核并上傳供全球共享。在所有ST型中,ST-3為優(yōu)勢序列型,共34株,且均為ERIC-19類群,并廣泛存在于不同地點、不同年份、不同來源的分離株中。結(jié)合菌株來源發(fā)現(xiàn):MLST分型對環(huán)境分離株的分辨力即辛普森指數(shù)(D值)最高,達0.99,

8、食品分離株為0.96,而臨床分離株僅為0.76,暗示 MLST分型對于臨床分離株的分辨力相對較弱,而對于非臨床株則是非常有效的分型手段。通過Mega軟件聚類分析表明, ST-305、ST-830與ST-3、ST-155與ST-794分別存在較近的親緣關(guān)系,具有較高的基因水平相似度。
　　本研究分別采用傳統(tǒng)血清分型、ERIC-PCR分型和MLST分型方法,對長三角地區(qū)的109株副溶血弧菌臨床、食品和環(huán)境分離株進行了分型研究,既對三種