哈維氏弧菌毒力相關(guān)基因的篩查及快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、哈維氏弧菌(Vibrio harvevi)是一種革蘭氏陰性、發(fā)光的海洋細(xì)菌，在海洋環(huán)境中分布廣泛。哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的重要致病菌，近年來給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測技術(shù)成為研究的重要方向和生產(chǎn)發(fā)展的急需，本研究擬建立哈維氏弧菌的快速檢測技術(shù)。另外，目前已知哈維氏弧菌的致病性可能與其胞外產(chǎn)物中的溶血素、蛋白酶(包括絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶)、磷脂酶和脂酶等相關(guān)，至于是否還有其它毒力因子，尚不十分清

2、楚。本文擬對(duì)toxS,tcpA，zot, flaB和flaC五種其他弧菌中的重要毒力基因在哈維氏弧菌中的分布進(jìn)行篩查。 toxR(toxin regulator)基因是在弧菌中廣泛分布的毒力基因的表達(dá)調(diào)控基因，能對(duì)多種弧菌毒力基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，而且不同弧菌的toxR序列同源性較低。本文根據(jù)哈維氏弧菌toxR基因片段(AY247418)，設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)56株弧菌進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)20株哈維氏弧菌(包括兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株)均可以擴(kuò)

3、增出382 bp的片段，檢出率為100％，并對(duì)從養(yǎng)殖場發(fā)病魚中分離的21株菌株進(jìn)行檢測，檢測出哈維氏弧菌9株，檢出率為42.85％，其菌株號(hào)分別為XVP5、TA-1、FA-1、FM-1、C-12D、R2-16K、CY-16D、CC-36D和Vang。從這些所檢測的陽性結(jié)果中，任意選取兩株(XVP5和FA-1)進(jìn)行16SrRNA測序，將測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA進(jìn)行比對(duì)，用DNASTAR軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化

4、樹，結(jié)果證明這兩株菌為哈維氏弧菌。從DNA提取到PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)束整個(gè)檢測過程，所用時(shí)間不到5個(gè)小時(shí)，檢測的菌樣最低濃度4.0×10<'3>cfu.ml<'-1>。由此建立了一種快速、特異、靈敏度較高的檢測哈維氏弧菌的方法。 而哈維氏弧菌的toxR基因是否對(duì)毒力基因有調(diào)控作用，目前還不清楚。此前僅知道哈維氏弧菌toxR基因的部分序列，本文將克隆toxR基因全長，為進(jìn)一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)。 toxR對(duì)霍亂弧菌和副溶

5、血弧菌的毒力基因表達(dá)起重要作用，并能促進(jìn)創(chuàng)傷弧菌溶血素基因的表達(dá)，且對(duì)其外膜蛋白OMP(outer membrane proteins)表達(dá)起調(diào)控作用。在鰻弧菌中，只發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控OMP的表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)其對(duì)毒力基因的調(diào)控作用。哈維氏弧菌的toxR基因是否對(duì)毒力基因有調(diào)控作用，目前還不清楚。此前僅知道哈維氏弧菌toxR基因的部分序列，因此克隆toxR基因的全長，成為下一步研究的首要條件。本文利用LAPCR試劑盒，設(shè)計(jì)內(nèi)外兩對(duì)引物，根據(jù)試劑

6、盒的操作步驟，通過連續(xù)兩次PCR，成功地克隆了哈維氏弧菌toxR基因的部分未知序列，并進(jìn)行了序列測定。 toxS,tcpA，zot,flaB和flaC是霍亂弧菌和副溶血弧菌的重要毒力基因。本文根據(jù)GenBank提供的序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR檢測它們?cè)诠S氏弧菌中的分布情況。結(jié)果顯示，toxS基因在25株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(2株哈維氏弧菌的結(jié)果為陰性)中，有8株P(guān)CR擴(kuò)增獲得特異性片段，其它哈維氏弧菌中有4株結(jié)果為陽性。zot基因在25株弧菌標(biāo)

7、準(zhǔn)菌株(2株哈維氏弧菌的結(jié)果為陰性)中有2株獲得目的片段，其它哈維氏弧菌結(jié)果為陰性。tcpd在25株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(2株哈維氏弧菌的結(jié)果為陰性)中有4株結(jié)果為陽性，其它哈維氏弧菌結(jié)果為陰性。flaB在25株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(2株哈維氏弧菌的結(jié)果為陽性)有11株結(jié)果為陽性，其它哈維氏弧菌28株結(jié)果為陽性。flaC在25株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中(2株哈維氏弧菌的結(jié)果為陰性)有13株結(jié)果為陽性，其它哈維氏弧菌中12株結(jié)果為陽性。將不同的哈維氏弧菌菌株注射斑