哈維氏弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的研究.pdf

1、活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but noncuhurable state，VBNC)，即致病菌處于不良環(huán)境條件下，其細胞縮成球形，用常規(guī)方法培養(yǎng)不能使其生長繁殖，但仍然具有代謝活性的狀態(tài)。本文對哈維氏弧菌(Fibrio harveyi)標準菌株VIB295，野生菌株CW2和SF1的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的進入、復蘇，進入VBNC狀態(tài)后的形態(tài)變化、毒力特征以及復蘇后弧菌的特性進行了研究。 實驗采用的誘導條件是低溫寡營養(yǎng)，將弧菌接種于

2、過濾陳海水中4℃誘導，發(fā)現(xiàn)幾株哈維氏弧菌進入VBNC狀態(tài)的時間分別為：標準菌株VIB295需要65天，CW2需要67天，SF1需要69天。采用吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計數(shù)法(AODC)、活菌直接計數(shù)法(DVC)和涂布平板法(PC)計數(shù)結(jié)果表明，當實驗菌株進入VBNC狀態(tài)時，它們的總菌數(shù)與接種濃度相比幾乎沒有太大變化，活菌數(shù)則比總菌數(shù)低兩個數(shù)量級，并且保持穩(wěn)定，可培養(yǎng)菌數(shù)為零。 對實驗菌株的復蘇采用了多種方法，包括直接升溫法，逐步

3、升溫法，添加營養(yǎng)物質(zhì)以及化學元素法，最后實現(xiàn)復蘇的是添加酵母液和吐溫20或復合維生素B，復蘇時間為：添加吐溫20需要5天，添加復合維生素B需要8天，復蘇后的弧菌可培養(yǎng)菌數(shù)接近接種濃度。 對正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)和復蘇后的弧菌的形態(tài)研究采用了熒光顯微鏡和掃描電鏡技術(shù)。結(jié)果表明，進入VBNC狀態(tài)后，這幾株菌在形態(tài)上發(fā)生了一致的變化：由原來的桿狀、短桿狀或弧狀變成球狀，并且體積比正常狀態(tài)的弧菌明顯縮?。粡吞K后的弧菌與正常狀態(tài)弧菌相比幾

4、乎沒有差異。 將正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)和復蘇后的弧菌分別注射斑馬魚進行毒力實驗發(fā)現(xiàn)，注射VBNC狀態(tài)的哈維氏弧菌細胞的斑馬魚在實驗期間沒有出現(xiàn)發(fā)病或死亡現(xiàn)象。注射了復蘇后哈維氏弧菌的斑馬魚在7天內(nèi)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，病灶部位水腫，充血；計算其半數(shù)致死劑量發(fā)現(xiàn)復蘇后哈維氏弧菌對斑馬魚的半致死量與正常狀態(tài)的哈維氏弧菌相似。結(jié)果表明，VBNC狀態(tài)的哈維氏弧菌可能保持了它的致病潛能，伴隨著復蘇的實現(xiàn)，它的致病力也得以恢復。在分子層面的研究證實