哈維氏弧菌GST、GPx疫苗制備及其對(duì)斜帶石斑魚(yú)的免疫保護(hù)作用.pdf

1、哈維氏弧菌是一種棲息在水生和海洋環(huán)境的革蘭氏陰性細(xì)菌,影響許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。它是甲殼類(lèi)動(dòng)物和誘導(dǎo)養(yǎng)殖對(duì)蝦發(fā)光弧菌病的病原體,它也是一種魚(yú)類(lèi)病原菌,感染多種物種,給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,水產(chǎn)養(yǎng)殖控制弧菌病主要是依賴(lài)抗生素,但由此帶來(lái)的各種副作用如細(xì)菌耐藥性,環(huán)境污染相關(guān)聯(lián)以及食品安全危害日益明顯。近幾年,人們轉(zhuǎn)向了從基因工程方向來(lái)防治弧菌病。
　　生物體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的自由基,體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)(抗氧化劑和酶類(lèi))

2、能及時(shí)清除從而維持自由基代謝平衡。在生物體內(nèi),常規(guī)生理濃度的活性氧(ROS)是維持正常細(xì)胞生理功能所需的,而過(guò)量的ROS則會(huì)對(duì)生物分子造成傷害。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)等組成了體內(nèi)微型抗氧化系統(tǒng),在維持生物體內(nèi)活性氧(ROS)的平衡具有非常重要的作用,能有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。
　　本研究通過(guò)同源引物從哈維氏弧菌ZJ0603基因組擴(kuò)增得GST和GP

3、x基因ORF,將兩個(gè)基因分別克隆 pMD-18T載體測(cè)序,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。GST基因 ORF全長(zhǎng)615 bp,編碼204個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。氨基酸序列經(jīng)過(guò)Blast對(duì)比,該基因與Owensii弧菌、輪蟲(chóng)弧菌、坎貝爾弧菌的序列相似性分別為99％、99%、97%。GPx基因ORF除去信號(hào)肽全長(zhǎng)477 bp,編碼158個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。氨基酸序列經(jīng)過(guò)Blast對(duì)比,該基因與Owensii弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌的序列相似性分別為9

4、9%、99%、97%。
　　將兩個(gè)基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+),構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST和pET-GPx,且在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得大量表達(dá)。GST在37℃、4小時(shí)、IPTG濃度0.08 mmol/L表達(dá)量達(dá)到最高;而GPx在37℃、6小時(shí)、IPTG濃度0.1mmol/L表達(dá)量達(dá)到最高。通過(guò)鎳親和層析分離純化GST、GPx蛋白,SDS-PAGE分析表明,純化的蛋白為單一條帶,分子量分別為28.2

5、kDa和22.2kDa。
　　通過(guò)腹腔注射純化的重組 GST、GPx蛋白免疫斜帶石斑魚(yú),5周后用致病性V.harveyi進(jìn)行人工感染試驗(yàn),對(duì)斜帶石斑魚(yú)的免疫保護(hù)率分別為72.5%、77.5%;ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,所有試驗(yàn)組魚(yú)都可檢測(cè)到抗體,而且在第35d抗體達(dá)到峰值,表明這兩個(gè)基因具有較好的免疫保護(hù)效應(yīng)。
　　針對(duì)哈維氏弧菌 GST、GPx基因分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA-GST和pcDNA-GPx,并通過(guò)肌肉注射斜